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通过旷场实验、Morris水迷宫实验观察大鼠的情感行为和学习记忆
点击次数:130 发布时间:2019-09-17

龟鹿二仙胶对创伤后应激障碍模型大鼠行为学 及海马GR、5-HT受体表达的影响

目的:观察龟鹿二仙胶对创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)模型大鼠行为学,海马糖皮质激素受 体(glucocorticoid receptors, GR) 5-羟色胺5-iydroxytryptamine, 5-HT)受体 1A 亚型5-HT1A)2A 亚型5-HT2A)表达的 影响。方法:采用单一延chang刺激方法制作大鼠PTSD模型,通过旷场实验、拒俘反应实验以及Morris水迷宫实验观察大鼠 的情感行为和学习记忆能力的改变。采用RTTCR法检测海马GR5-iT1A5-HT2A受体表达。结果:PTSD大鼠表现 出多种情感行为障碍,学习能力显著降低(P <0.01)。海马GR表达增强(P <0.01),5-HT1A受体表达下降(P <0.05), 5-HT2A受体表达则升高(P <0. 05)。龟鹿二仙胶(2.025 g ?kg ?1)和ying羊藿总黄酮0. 06 g ?kg?1)能显著改善PTSD大 鼠的情感行为障碍,提高学习记忆能力P<0. 05P<0. 01)。龟鹿二仙胶2.025 g ?kg?1)和ying羊藿总黄酮0.06 g ?kg1)可以明显降低PTSD大鼠海马GR的表达水平,升高5-HT1A受体表达水平和降低5-HT2A受体表达水平(P < 0.05P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶对PTSD具有良好的干预治疗作用,其作用机理与改善情感行为和认知功能以及调 节海马GR5-HT1A5-HT2A受体表达有关。

 

近年来创伤后应激障碍post~traumatic stress disorder, PTSD)的患病率呈逐年上升趋势mPTSD 属于精神心理综合征的范畴,是个体经历超常的威 胁性灾难性的创伤事件后呈现最典型最常见的 身心障碍0PTSD不仅给个人、家庭带来极大负 担,还进一步影响着社会的稳定和谐。中医药以其 独特的理论和治法方药在防治PTSD研究方面,显 示出良好的应用前景。本课题组以‘‘肾藏精,在志 应恐”的中医理论为指导,运用龟鹿二仙胶开展防 治PTSD的相关研究。初步的研究结果表明,龟鹿 二仙胶对条件性恐惧记忆的形成具有抑制作用H。 本实验通过建立PTSD大鼠模型,观察大鼠行为学、 海马糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)5-羟色胺(5~hydroxytryptamine, 5~HT)受体 1A 亚型 (5~HT1A)、A亚型(5~HT2A)表达的影响,进一步 明确龟鹿二仙胶防治PTSD的效应及其部分机理。

1材料与方法

1.1实验药物龟鹿二仙胶:产品购自河南省新四 方制药有限公司,国药准字Z41022262,批号: 090105,规格:每瓶200 g。ying羊藿总黄酮:产品购自 陕西省西安市天园生物制剂厂,批号:TY20090620, 规格:每瓶200 g。ying羊藿总黄酮用蒸馏水配制为 30 g • L-1的溶液每次配制250 mL,置于4 °C冰箱 内保存备用。盐酸氟西汀胶囊:产品购自美国礼来 苏州制药有限公司,规格:每粒20 mg,批号: 204362,用生理盐水将胶囊内粉末配制成0. 18 g • L-1混悬液,4 C冰箱内保存备用。

1.2 实验动物 SPF Sprague-Dawley (SD)雄性 大鼠,体质量(180 ±20) g,购于广州中医药大学实 验动物中心(实验动物质量合格证号分别为: 0061199,0065089,0067723),自由饮食在光暗周期 为12 h,温度为(23 ±2) °C通风良好的实验室条件 532

适应性喂养7 d每天轻抚大鼠5 min,使其逐渐适 应实验者的操作。

1.3实验试剂Trizol提取总RNA试剂盒(美国 Invitrogen公司,逆转录■聚合酶链式反应试剂盒、 TaqDNA 聚合酶dNTPAccess QuickRT-PCR sys-tem (美国 Promega 公司SYBR Green 荧光染料 (美 国 Gibco 公司SYBR Green PCR Master Mix (美国 MJ公司PCR引物合成(上海生工生物工程技术 服务有限公司

1.4实验仪器XR-XZ301大鼠旷场实验分析系 统上海欣软信息科技有限公司水迷宫Smart视 频追踪系统San Diego Instrument,美国LE-CEND MICRO 21R台式高速冷冻离心机Th ermo 公司,美 国Prism 7000 型 Real-time Quantitative PCR system (MJ公司美国

1.5实验方法实验动物按体质量随机分为7组, 即对照组,模型组,龟鹿二仙胶高剂量组、低剂量组, ying羊藿总黄酮高剂量组、低剂量组,盐酸氟西汀组。 对照组不应激、不给药,灌服等量生理盐水;模型组 给予单_延chang刺激,不给药,灌服等量生理盐水。龟 鹿二仙胶高剂量组、低剂量组第1天造模,第2天开 始每天分别给予龟鹿二仙胶1. 012 5 g • kg-12.025 g • kg-1灌胃,连续14 d。ying羊藿总黄酮高剂 量组、低剂量组第1天造模,第2天开始每天分别给 予ying羊藿总黄酮0. 03 g • kg-10. 06 g • kg-1灌 胃连续14 d盐酸氟西汀组第1天造模第2天开 始每天给予盐酸氟西汀1.8 mg • kg-1灌胃,连续 14 d各组大鼠第16天进行旷场实验、拒俘反应实 验Morris水迷宫实验等。

1.5.1 PTSD模型制作采用国际公认的单一延

chang刺激(single-prolonged stress, SPS)造模方法由 2005年日本文部省召开的“基础和临床研究进展” 国际会议确定4 ,单_延chang刺激处理步骤如下:将

大鼠禁锢2 h后,立即强迫游泳20 min (水温25 °C , 水深40 cm),休息15 min,yi醚麻醉至意识丧失, 不再给予任何刺激,在笼中自然苏醒,常规饲养直至 取材。禁锢过程中采用的材料为锥体形的硬质塑料 筒,其长度和直径可根据大鼠体形的特点进行调节。 大鼠尾部始终暴露在禁锢材料外,其躯干及四肢不 受压迫,但无法自由活动。

1.5.2旷场实验实验装置包括旷场反应箱和数 据自动采集和处理系统两部分,大鼠旷场反应箱内 全涂黑箱高40 cm,底边长100 cm,底面平均分设 25个小方格(4 cm X 4 cm),正上方2 m处固定数码 摄像头,视野范围覆盖旷场内部。旷场白天光照由 两侧墙壁的4只节能灯发出约200 lux照度来模拟, 夜晚照明由一侧墙的红外光源提供。室内隔音。观 察5 min内大鼠的行为表现,指标包括水平活动距 离,直立、呆滞、修饰行为次数,排便颗粒数。每次实 验均在上午7 : 00 -12 : 00进行,两次实验之间将 箱底打扫干净。

1.5.3拒俘反应实验用手套(大鼠从未接触过) 轻抓大鼠,观察并记录其反应。具体记分标准如下: 0分,很容易抓取;1分,尖叫或回避;2分尖叫并回 避;3分,逃脱;4分逃脱并尖叫;5分试图撕咬手 套;6分,主动跃起攻击。根据评分来评价大鼠恐惧 与冲突素质特征改变5

  • Morris水迷宫实验各组大鼠第16天进 行Morris水迷宫实验水温设定为25 C,实验方法 参照文献6]进行。首先进行大鼠寻找水中平台 (高出水面1 cm)的训练,每只大鼠先置于平台上适 应25 s,然后从NSEW4个不同象限的入水点将 其投入水中,若超过60 s大鼠仍未抵平台,由实验 者引导其回到平台上停留15 s,如此重复3次擦干 大鼠放回饲养笼。同天进行定位航行实验。测试 时,随机从NSEW 4个象限中任一象限将大鼠面 向池壁放入水中进行观察。若大鼠找到平台,并在 平台上停留5 s视频追踪系统停止记录大鼠找 到平台前在水中游泳的这段时间记为逃避潜伏期 (escape latency, EL)若大鼠60 s内未找到平台, 此时的EL记为60 s定位航行实验连续测试5 d, 每天1次,记录大鼠的EL第5天的测试结果作为 各组大鼠空间学习记忆能力。
  • 海马 GR、5^mA、54IT2A 受体 mRNA 

RT~PCR法检测。各组动物麻醉后断头取脑, 在冰台上快速分离海马组织,置于-80 C冰箱保 存。使用的试验器材均经灭活RNA酶处理。采用 TrizolRNA提取试剂盒提取标本中的总RNA,以 提取的总RNA为模板,按试剂盒说明将总RNA逆 转录成cDNA后检测海马中GR、5-HT1A、5-HT2A 受体mRNA的表达量。PCR扩增条件为:95 C10 min,95 C15 s,60 C20 s,72 C30 s,共 40 个循环。 建立双标准曲线:取对照样本cDNA, 10倍梯度稀释 后,各取样品2 ^L作为模板,然后用目的基因引物 和内参基因引物分别进行扩增。同时在75 ~90 C 进行溶解曲线分析,并绘制出目的基因和内参基因 的标准曲线。将各样品cDNA进行4倍梯度稀释, 稀释后取2卟作模板,分别用目的基因引物和内参 基因引物进行扩增,同时在75 ~90 C分析溶解曲 线。采用 Prism 7000 型 Real~time Quantitative PCR 仪检测,以管家基因甘油醛-3磷酸脱氢酶glyceral- dehyde-5~phosphate dehydrogenase, GAPDH)作为内 参,采用2-^法&]分析GR、5-HT1A、5~HT2A受体 的基因相对表达量。2- AACt法相对定量分析结果判 定:循环阈值。PCR引物序列:GAPDH上游:5'- ACATGCCGCGTGGAGAAACCT-3',下游:5'~GCCCA- GGATGCCCTTTAGTGG-3'; GR 上游:5'-AGCAGAG- AATGTCTCTAC-3',下游:5'~GGAATTCAATACTCAT- GGTC-3'; 5-HT1A 上游:5'-TCACCTGCGACCTGTT- TATC-3',下游:5'-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3';5- HT2A 上游:5'-CATCATGGCAGTGTCCCTAG-3',下 游:5'-GGTAAATCCAGATCGCACAG-3'

AQ = Ct样品均值Ct内参均值

AACt = AQ - (Q阴性对照样品均值-Ct内参均值

1.6统计学方法采用SPSS 20. 0统计学软件,实 验结果以均数±标准差(x ± s)表示,组间比较采用 LSD法。P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠旷场实验结果比较与对照组比较, 模型组大鼠在水平活动距离,直立、呆滞、修饰行为 次数,排便颗粒数等方面均有显著改变(P <0. 01); 龟鹿二仙胶(2.025 g • kg-1)和ying羊藿总黄酮(0.06 g • kg-1)PTSD大鼠旷场行为学指标均有显著改 善(P <0.05 P <0.01)

 

PTSD的主要临床表现包括创伤性事件的再体 验、持续性高警觉、闪回和麻木。单一延chang刺激造模 方法包含心理应激(禁锢)、生理应激(强迫游泳、yi醚麻醉),模拟出人类在自然环境中可能遭受到的

 

主要应激类型,能使大鼠出现惊恐行为、活动度降 低、学习和记忆能力减弱等多种PTSD样的精神和 行为异常08 ,是目前较为成功的PTSD动物模型。

旷场实验是检测动物情绪唤醒水平、神经精神 变化的一种重要方法,对于量化分析实验动物的精 神紧张度、警觉水平、焦灼状态、环境适应能力等具 有重要意义°3。本研究中旷场实验和拒俘反应实 验的结果显示,PTSD大鼠活动习性明显改变、警觉 水平增高、环境适应能力明显下降,始终表现出受惊 吓逃避的情感应激反应;拒俘反应性呈现同步显著 增强,容易激惹、挣扎行为明显,冲突特性增强。 Morris水迷宫实验结果显示,PTSD大鼠逃避潜伏期 明显延长,说明其学习能力显著降低,存在着显著的 认知功能障碍。

下丘脑-垂体-肾上腺hypothalamus—)ituitary~ad- renal gland, HPA)轴是参与应激反应并对应激进行 有效调控的神经内分泌系统。大量的研究已经证 实,PTSD患者存在着HPA轴功能的紊乱M。糖皮 质激素是HPA轴分泌的主要应激激素。 Quervain 011通过临床试验证实,提高体内糖皮质激素的水 平能够抑制恐惧记忆的重现,从而减轻PTSD和恐 惧症患者的症状。海马是参与环境调控条件性恐惧 的重要脑区M ,同时也是HPA轴的重要调节位点。 海马中的GR密度远高于其他脑区013 ,糖皮质激素 通过与GR和盐皮质激素受体结合发挥生物学效 应,GR在糖皮质激素的负反馈调节以维持HPA轴 功能平衡中起着重要的作用M

研究结果显示,GR的表达水平升高015 ,本实验 的结果也显示PTSD大鼠海马GR的表达增强,这与 PTSD糖皮质激素对HPA轴负反馈抑制作用增强是 致的;而GR的高表达可能与PTSD的情感行为障 碍、认知功能受损的发生发展过程有关。

关于PTSD的发病机制目前尚不明确,但大量 文献结果表明,5~HT水平异常与PTSD的发生密切 相关,抗抑郁药5~HT重摄取抑制剂作为治疗PTSD 的shou选方案M5~HT可能通过5-羟色胺转运体、 5-HT受体以及与多巴胺、去甲肾上腺素等的相互作 用参与PTSD的发生017。海马富含突触后膜5- HT1A受体,5~HT1A受体和情感障碍关系非常密 切018。有研究表明,PTSD动物5-HT1A受体活性 与下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素有关,并且参 与杏仁核神经元凋亡过程13。研究表明,5~HT释 放产生的焦虑效应主要产生于5-HT2A受体的激 活。此外,应激发生时5-HT还可能通过5-HT2A受 体发挥对HPA轴的调控作用020。单程长时应激2 周后,海马脑区中5~HT2A受体亲和力和受体数目 明显增加;不可逃避刺激可使海马、杏仁核以及下丘 脑5-HT2A受体表达呈升高趋势020。临床研究也 发现,5~HT2A受体拮抗剂萘法唑酮对战争相关的 PTSD患者具有明显改善作用021。本实验结果显 示,PTSD大鼠海马5~HT1A受体表达下降,而5- HT2A受体表达升高,说明单一延chang刺激应激可能 通过影响5-HT1A受体和5-HT2A受体mRNA的表 达,进而影响海马对情绪反应、学习记忆等的调节功 能,参与PTSD的一系列精神情感障碍以及认知功 能减退等病理过程的发生。

PTSD属于中医情志病的范畴。中医认为,“脑 为髓之海’“肾主骨生髓’“肾藏精,在志应恐”。因 此,肾可视为与恐相应的机体情志活动的储备之脏, 而涵藏于肾中的精气则是情志活动必备的物质基 础。肾中精气充盈与否与机体情志活动能否正常发 挥关系密切。基于中医“肾藏精,在志为恐”理论, 笔者认为,PTSD的发生是内因和外因协同作用的结 果。外因主要源于外界重大创伤性事件的强烈刺 激,内因主要由于稟赋不足或久病暗耗所致的肾精 不足,使机体应对外界刺激的整体能力下降。精足 则神旺,肾精不足,脑髓失养,则易引发恐惧、焦虑、 抑郁、绝望等各种情志活动的异常。肾藏志应恐,惊 恐伤肾,气机逆乱,则气下精伤,志意失藏,进而累及 五脏整体功能出现异常。因此,PTSD发病的中医核 心病机凝炼为“肾精不足,封藏失职,志气衰败”。 有研究发现,补肾方药金匮肾气丸可有效纠正地震 恐惧导致的子鼠神经发育迟缓等,对受恐惧影响的 大鼠其血清皮质酮、神经递质(5~HTDA)等出现的 代谢紊乱具有调节作用022 ,可明显改善PTSD患者 对单一西药治疗药物的依赖性和核心症状、抑郁和 焦虑状态023 ;滋补肾精方药能提高“恐伤肾”雌性小 鼠的雌二醇、促卵泡激素和黄体生成素水平024 ;温 补肾阳方药能明显改善PTSD大鼠Open-Field评 分、糖水摄取量、血浆17-)HCScAMP025

龟鹿二仙胶是中医临床治疗各科虚证的基本 方,由鹿角胶、龟板胶、枸杞子、人参组成。鹿角胶能 补肾阳、生精血;龟板胶能滋阴潜阳,补血;人参大补 元气而生津;枸杞子益精生血。诸药合用,共奏补肾 填精、益气养血、阴阳并补之功效。我们前期研究工 作表明,龟鹿二仙胶能明显抑制肾虚大鼠恐惧记忆 的形成,促进恐惧消退02。本研究发现,在行为学 方面,龟鹿二仙胶能降低PTSD大鼠的高警觉水平 以及惊恐逃避情感反应,提高大鼠的学习记忆能力 和认知功能。此外,龟鹿二仙胶可以降低PTSD大 鼠海马GR的表达水平,调节PTSD出现的HPA轴 功能紊乱;同时,龟鹿二仙胶还可通过升高PTSD大 鼠海马5~HT1A受体表达水平和降低5~HT2A受体 表达水平,参与PTSD情感障碍的调节。

综上,龟鹿二仙胶对PTSD具有良好的干预治 疗效应,其作用机理与改善情感行为和认知功能以 及调节海马GR、5-HT1A5-HT2A受体表达有关。

 

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