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Morris水迷宫实验对慢性疲劳模型大鼠认知及海马神经颗粒素表达的影响
点击次数:656 发布时间:2019-09-23

龟鹿益神颗粒对慢性疲劳模型大鼠认知行为及大鼠皮质和海马神经颗粒素表达的影响

 

摘要:目的观测慢性疲劳CFS)模型大鼠认知的行为水平变化,探索龟鹿益神颗粒对慢性疲劳综合征发挥干预作用的 机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为空白组,模型对照组,苁蓉益肾颗粒对照组、龟鹿益神颗粒低剂量组、龟鹿益神 颗粒中剂量组、龟鹿益神颗粒高剂量组,共6组,每组各10只。除空白组外,其它各组用力竭游泳、慢性束缚双重复合应 激构建慢性疲劳大鼠模型,前后造模14 d,随后,空白组,模型组每天给予生理盐水灌服,其它各组给予相应药物灌服,应 用Morris水迷宫实验评价大鼠其认知行为水平,末次灌胃24 h后解剖大鼠并取材,取大鼠前脑皮质及海马等组织,采用 蛋白印迹(Westem blotting, WB)试验方法分别测定大鼠皮质及海马中神经颗粒素Ng)蛋白表达结果。结果造模成功 及给药后Morris水迷宫实验:与模型组相比,重复测量第4天起,龟鹿益神颗粒中、高剂量组及苁蓉益肾颗粒对照组的逃 避潜伏期明显减低P<〇. 01);穿越平台次数明显升高P<〇.〇5)。神经颗粒素蛋白表达水平:和模型组相比较,苁蓉益 肾对照组、龟鹿益神低、中、高剂量各组Ng表达水平明显升高(P <0.05);和苁蓉益肾颗粒对照组比较,龟鹿益神颗粒中、 高剂量组的Ng表达水平明显升高(P <0. 05)。结论龟鹿益神颗粒能够明显改善慢性疲劳模型大鼠认知行为水平,并提 高神经系统中,Ng蛋白的表达,其二者间的关系可能是该药对慢性疲劳综合征发挥治疗作用的机制之一。

关键词:慢性疲劳综合征;龟鹿益神颗粒;神经颗粒素 DOI 标识:

美国疾病控制中心CDC)于1988年命名了慢性疲劳综合征 (Chronic Fatigue Syndrome, CFS),其突出症状是持续不能改善的 疲惫感,并以低热、头痛、咽痛、肌痛、记忆力衰退、注意力难以集 中、抑郁和睡眠功能障碍为其非特异性表现1。并且CDC在 1994年重修慢性疲劳综合征诊断标准的时,将认知功能障碍作 出详细定义,主要为注意力集中困难和短期记忆障碍2]CFS其 临床特征符合中医学中“虚劳’ “虚损’“脏躁’“健忘”等范畴,其 中我们在长期临床工作中观察到,以持续疲劳伴有记忆力减退等 认知功能障碍的CFS患者多见以肾精亏虚为本病的主证,患者 常可见到精神萎顿,眼神涣散、反应迟钝、四肢无力、记忆力减退, 同时或见腰膝酸软或冷痛,四肢不温,xing欲淡漠、头昏目眩、舌淡 少苔,脉沉弱等肾精亏虚证候的表现,在治疗中以‘‘补肾填精、充 养髓海”为原则,常应用龟鹿益神颗粒加减施治,取得较满意疗 效。遂本研究通过“慢性束缚+力竭游泳”的复合应激造模方 法,进行大鼠模型构建,并应用Morris水迷宫测定逃避潜伏期及 撤除站台后穿越原站台所在区域的频数来评价研究对象的认知 功能变化水平,并观察龟鹿益神颗粒对慢性疲劳大鼠认知水准的

改善及皮质和海马中神经颗粒素(Ng)的定量表达水平的改善, 以期对该方药干预治疗CFS的机制及效用作出初步探索。

1材料仪器与方法

1.1动物及分组SPF级雄性SD大鼠60体重240 ± 20) g随机分为6组:空白组正常组模型对照组苁蓉益肾对照组, 龟鹿益神低剂量组,龟鹿益神中剂量组,龟鹿益神高剂量组,每组 10只。

1.2药物龟鹿益神颗粒方药组成及规格如下:人参颗粒2. 5g x1袋;枸杞颗粒4gx1袋;醋龟板颗粒0.5gx1袋;鹿角霜颗粒 0.5gx1袋;仙鹤草颗粒1gx1袋;仙鹤草约相当于饮片15g,余 各颗粒均等效于饮片约10g,来源自江阴天江药业所产中药小包 装颗粒剂。苁蓉益肾颗粒:内蒙古兰太药业有限责任公司生产, 产品批号:16091601,国药准字Z20030099,规格每袋装2g水合 氯醛。

1.3试剂和仪器试剂:RIPA裂解液:北京索来宝公司,货号 R0020;—抗:Neurogranin,北京博奥森货号 bs - 1143R;内参:|3 -actm单克隆抗体,购自中杉金桥公司,货号TA -09;二抗:辣根 标记山羊抗兔IgG抗体,购自中杉金桥公司,货号ZB2301; ECL 发光试剂盒:中杉金桥公司,货号sc - 2048; PVDF膜:Millipore公 司,货号IPVH00010;X射线胶片:Carestream公司,型号XBT

仪器:称量天平:Sartorius公司BP310P型;低温高速离心 机:Eppendorf 公司centrifuge5417R 型;超低温冰箱:SANYO 公 司MDF - U72V型;超纯水仪:北京康铭泰克科技发展有限公司, 蛋白浓度定量仪:Eppendorf公司22331 hamburg型;电泳仪:北 京六一公司,DYCZ -24DN型;半干转膜仪系统:ATTO公司, WSE -4040型;转移脱色摇床:海门其林贝尔仪器,TS -8型;移 液器:Eppendorf公司;分析仪器:Tanon公司,Ta600型。Mor- ris水迷宫系统:上海欣软信息科技公司;XR - XM101型。

1.4造模及给药方法采取冷水力竭游泳、慢性束缚的方法制备 CSF模型。慢性束缚:将大鼠置于自制束缚筒(选用圆柱形塑制 瓶18 cm,内径约6cm,前缘为漏斗样通气口内径为1.5 cm束缚筒尾端为活动封盖大鼠束缚过程可正常呼吸使其活动 受限。慢性束缚起始时间30min/d,3天加量15min,逐渐加量 至90min,以免大鼠逐渐顺应3。力竭游泳:自制80 cm X 65 cm x55 cm泳箱泳箱四壁光滑水深约45 cm,超过大鼠身长(包括 鼠尾水温20 ±2大鼠头部没入水下10 s不能回到水面或泳 姿无力失调作为其力竭评判标准,每天进行14。造模共14 天,正常组不造模,余5组均给予慢性束缚加力竭游泳。造模过 程中,龟鹿益神颗粒低剂量组2只死亡脱落,正常组及龟鹿益神 颗粒中、高剂量组各1只死亡脱落,予以剔除。

模型制备后,给药阶段,正常组和模型组予以生理盐水灌胃, 10 mlK kg d),苁蓉益肾对照组给予相应药物颗粒混悬液灌 胃,417 mgK kg d);龟鹿益神低、中、高剂量组依次按照1.625 g/ ( kg d). 25 g/ ( kg d)6. 5 g/ ( kg d)制备龟鹿益神颗 粒混悬液,并灌胃1/ d,连续14 d实验结束后,停药进食12 h后取材,每只大鼠按3 ml/ kg给予10%水合氯醛腹腔注射,麻 醉后,断头切取前脑皮质及海马,分别置入冻存管中,放进-20T冰柜中备用。

1.5观察指标

1.5.1认知行为指标Morris水迷宫实验:实验设备为内径约 160cm正圆蓄水池内壁涂黑30 cm水深水温(20 ±2) T,将 水域十字均分为均等面积的四个象限,随机选取任一象限设置一 站台,直径约12cm,站台隐于水面下1cm,水池正中央上方固定 摄像头采集图像,应用Ethovision软件进行后期图像处理。水迷 宫设备周遭参照物及光照环境实验期间前后一致。定位航行实 582 验:给药后5 d执行,从四个象限按随机象限次序将大鼠面朝 池壁置入水中,记录其在120 s内找到隐没于水下的站台并驻留 3 s以上所需的时长,即为逃避潜伏期时间。若120 s后大鼠仍未 寻找到站台,则将其诱导到站台上,且逗留15 s以上以学习记 忆,并将逃避潜伏期记录为120 s,取来自不同象限的逃避潜伏期 的数学平均数作每日测量数据,连续测量5 d空间探索实验:给 药完成后即定位巡航实验结束的第二曰进行,撤去原有站台,大 鼠随机象限入水,记录120s内其躯体穿越原站立台所在区域的 频次。

1.5.2蛋白印迹(Westem blotting, WB)试验方法实验前大鼠断 食水12 h,给予每只大鼠100 g/ L的水合氯醛腹腔注射以麻醉,3 mL/ kg,快速取出其前脑皮质及海马组织在生理盐水中涤去血 液,用滤纸拭干后,置于-80T的冰箱中待用。各组分别随机取 6只大鼠的前脑皮层组织和海马组织各50 mg,剪碎后于液氮研 磨至细粉末状,加入RIPA裂解液混匀,4低温存储箱内过夜裂 解。4T12000rpm离心10分钟,取上清。Eppendorf微量定样 仪测定蛋白浓度。上样SDS - PAGE电泳,PVDF膜转移,5%的 脱脂奶粉密闭2h加入Neurogranin -4T过夜。1 X PBST洗 涤3每次10min,将二抗用1 X PBST稀释3000倍;洗涤一抗 反应膜后,将其放入二抗工作液中,孵育1.5h洗膜,ECL显影 将胶片扫描后,P - actin作内参校正,用TanonGis软件检测条带 灰度值。以同一膜上Ng灰度值与内参p -actin灰度值的比值来 反应蛋白表达水平。

1.5.3统计学方法所有数据均采用SPSS21.0软件进行处理, GraphPad Prism5. 0Demo软件作图,计量资料以均数±标准差(X ± s)表示,水迷宫实验中的逃避潜伏期应用重复测量的多因素方 差分析进行分析:球形检验判断重复测量数据在各个时间点上的 关系是否满足Huynh Feldt条件,对不满足Huynh Feldt条件(P < 0. 05),则采用Greenhouse - Geisser法校正自由度,并应用多因素 方差分析每个时间点上的组间差异。余检测指标均应用单因素 方差分析进行统计处理,组间显著性差异水平为P <0.05

2结果

  • _般情况造模前,各组大鼠食量饮水量活动状况鼠毛 色泽、鼠粪性状等差异均无显著意义。制模完成后,造模大鼠食 量、饮水量、活动水平减少,鼠毛的色泽暗淡无光,便溏尾脏等;空 白组一般情况基本同造模前。给药后,苁蓉益肾对照组、龟鹿益 神低、中、高剂量各干预组大鼠进食及饮水量和活动状况改善均 有不同程度的增加,毛色由暗淡逐渐变为有光泽,溏便情况逐渐 转好至正常。
  • Morris水迷宫实验

2.2.1定位航行实验小鼠逃避潜伏期数据Mauchly球形检验 统计量:W = 0. 617P = 0. 006 < 0. 01,不满足球形假设采用 Greenhouse - Geisser法对自由度进行修正,结果显示时间因素 (day)有统计学意义F=30.449, P<0.01),各组小鼠逃避潜伏 期随时间变化而变化的趋势;时间和分组的交互作用day* group)有统计学意义(F = 1.72, P <0.05),说明时间因素的作用 随分组的不同而不同。见图1。每个时间点上两组之间两两比较 提示4天起,和模型组比较,正常组、苁蓉益肾对照组、龟鹿益 神颗粒中剂量组龟鹿益神颗粒高剂量组的逃避潜伏期明显降低 (P<0. 01);第4和苁蓉益肾对照组相比龟鹿益神中高剂 量组的逃避潜伏期明显降低(P <0. 05),第5天,和对照组相比, 龟鹿益神中高颗粒组逃避潜伏期差异无显著性意义(P > 0.05)。见图1及表1

2.2.2空间探索实验结果显示,和模型组相比,空白组、苁蓉益 肾对照组、龟鹿益神颗粒低、中、高各组穿越平台次数明显增加

 

神经颗粒素Ng)是一种由78个氨基酸组成的、具有钙离子 敏感性的钙调蛋白CAM)结合蛋白,也是蛋白激酶C(PKC)的突 触后底物[11]。主要在于人类及哺乳动物的皮质、海马、扣带回等 组织的神经元中的树突棘高度表达,目前主要学术观点认为Ng 通过参与神经元突触的可塑性调节,从而参与学习记忆等智 能活动的调节。主要通过以下几个方面:首先NgPKC的化学 底物,经过蛋白质磷酸化后发挥调控突触后神经递质受体的活 性,活化后的递质受体又可反调节以促进Ng的磷酸化,相互增 强,进而使突触传递的效能得到提高;第二,Ng可能是参与学习 记忆活动的主要蛋白激酶的下游靶点,通过自身的磷酸化作用, 参与到蛋白信号传导通路的调节,利于神经信号的传导;再者,长
时程增强LTP)是海马区域持续加强的突触联系的一种生理活 动,国外大量研究证明Ng是参与LTP产生和维持的重要物质基 础,可能与改变Ca2+CaM复合物浓度及相关蛋白酶活性相 关12。总之Ng通过参与神经递质、蛋白信号通路及长时程增强 的调节等诸多途径,达到调节神经突触结构和功能上的可塑性, 从而发挥对学习记忆等智能水平的影响。

本研究证明,多重应激因素复合制备慢性疲劳模型大鼠后, 其学习记忆能力明显减退,同时海马和前脑皮质中神经颗粒素的 蛋白表达含量显著降低(P <0.01),显示出疲劳应激所造成的认 知活动障碍与Ng表达减少具有高度相关性。应用龟鹿益神颗 粒实验干预及苁蓉益肾颗粒对照干预后,皮质及海马的Ng蛋白 表达水平明显升高,大鼠的学习记忆等智能活动能力显著提 高,表现出水迷宫实验中逃避潜伏期的降低和撤去平台后原平台 停留次数的增多。同时,在与苁蓉益肾对照组的比较中,在改善 学习记忆能力和Ng蛋白表达水平上,龟鹿益神中、高剂量组明 显优于对照组即苁蓉益肾组(P <0.01)

苁蓉益肾颗粒由肉苁蓉、巴戟天、五味子、菟丝子、车前子等 组成,具有填精益髓、补养肾气的作用,可用于肾气不足所致的腰 膝酸软、记忆减退、四肢无力等症状。现代药理研究证明,苁蓉益 肾颗粒具有显著的抗氣化抗疲劳的作用,可明显改善肾虚模型大 鼠的游泳时间及自主活动水平;对戊ba比妥na制备的记忆力障碍 大鼠起显著的改善智力的作用;并可提高环磷酰胺所致的免疫力 低下小鼠的免疫功能水平。国内学者沈小衍等[13]对符合肾气虚 辨证分型的30名CFS患者进行前后对照临床观察临床总有效 率可达86.7%。选取苁蓉益肾颗粒作为本研究的对照药物,符 合试验的设计要求。

龟鹿益神颗粒是为龟鹿二仙丹加味组成。龟鹿二仙丹出自 《医便》卷一,其主要组成为龟板胶、鹿角胶、人参、枸杞,以龟板 胶滋阴潜阳,强肾壮骨,鹿角胶养精育血,温补肝肾,二药合而为 君以充精填髓,补虚养精,人参益气健脾养血,枸杞滋补肝肾,在 原方之上加用仙鹤草扶正补虚,治劳力脱损。共奏充养肾精,益 气血,补虚劳之功效。明代医家形容其组方:“1阴一阳,无偏攻 之忧,入气入血,有和平之美……精生而气旺,气旺而神昌” [14。 本课题前期研究通过随机对照实验证实,龟鹿益神颗粒可明显增 加CFS模型大鼠的力竭游泳时间、旷场实验中的直立及跨格活 动次数,从而使疲劳大鼠的体力疲劳状态得到较明显好转,并能 明显增加骨骼肌中过氣化物酶激活受体Y辅激活因子1a (PCG -1a)的含量和血清中IL - 2阿片肽等含量从神经-内分泌- 免疫网络和细胞内线粒体的再生等方面发挥调控效用,从而治疗 慢性疲劳[1516。本实验研究进一步证明龟鹿益神颗粒可明显改

CFS大鼠的脑力疲损状况,提高学习记忆等智能活动水 平。其机制可能与其改善作为智能活动的物质基础之一的 神经颗粒素的表达状况,来参与神经突触可塑性的调剂,其详细 机制还有待更进_步的研究揭示另其与中医‘‘肾精”的充养之 间的关系有望得到进一步的探索和认识。

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