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多功能诱咳引喘仪防治哮喘大鼠气道炎症反应的作用
点击次数:486 发布时间:2019-09-03

摘要:目的探讨大豆肽soybean peptide, SP)通过下调Notch 1信号通路防治哮喘大鼠气道炎症反应的作用机制。方 法将60SD雄性大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松(DexamethaSone,Dex)0.5mg/kg组及大豆肽 600、300  150 mg/kg 剂量组。采用卵清蛋白Ovalbumin, OVA) + 氨氣化fAluminum hydroxide, Al (OH) 3)法复制大 鼠哮喘动物模型同时给予相应剂量的大豆肽进行干预每天给药1连续7 d末次给药24 h后收集大鼠肺泡灌洗 yebroncho - alveolar lavge fluid, BALF),进行白细胞分类计数;取大鼠右下叶肺组织常规HE染色观察肺组织病理学 改变及气道重塑变化;采用逆转录PCRWestern - blot法检测大鼠肺组织Notch 1Jagged 1Hes 1NF - kB mRNA 和蛋白表达水平。结果与哮喘模型组比较,大豆肽600 mg/kg剂量组大鼠BALF中的中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 性粒细胞计数显著降低P <0.01);大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善,炎性细胞浸润明显减少;大鼠肺组织 Notch 1、agged 1Hes 1NF - kB mRNA和蛋白表达水平明显下调P <0. 05,P <0. 01)。结论大豆肽对哮喘大鼠 炎症反应具有防治作用,其机制与下调Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-kB信号通路有关。

关键词:大豆肽;哮喘;Notch 1;炎症

支气管哮喘(bronchial asthma, BA)简称“哮喘是一种常见的呼吸系统炎症性病症,往往伴有巨噬细

作者简介:张玲(1981 -),女,本科,讲师,研究方向:呼吸系统疾病防治 通讯作者:徐松涛E - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞及中性粒细胞 等炎性细胞浸润和气道上皮细胞损伤,出现气道平滑 肌痉挛,表现为喘息、呼吸困难、气急、剧烈咳嗽等哮 喘症状1Notch 1信号通路是调控细胞分化、迁移、 凋亡、增殖、炎症及肿瘤发生等生理病理过程的重要 信号分子12。研究报道Notch 1信号通路激活后可 诱导气道成纤维细胞分化和增殖,促使气管重塑,引
发免疫系统紊乱,诱导炎症反应,从而引发和促进支 气管哮喘的发生发展。大豆肽soybean peptide, SP)是大豆经过酶解或微生物发酵分离提取得到的多 肽混合物,具有免疫调节、抗氧化、缓解疲劳等作 用。本研究观察了大豆肽对哮喘大鼠的防治作 用,并以Notch 1信号通路为研究对象探讨其抗炎平 喘分子机制。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠SPF雄性,w体 重180 ~200 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 许可证号:SCXK (湘2011 -0003。将大鼠适应性饲 养5d,每笼4 ~5只,3 ~4d更换1次垫料,调整室 内温度为 22 ±2°C,湿度为 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期,常规饮食水。

1.2主要试剂大豆肽,河南省南街村(集团有限 公司;地塞米松碟酸钠注射液Dexamethasone, Dex ) 国药准字H41020055,郑州卓峰制药有限公司;卵清 蛋白Ovalbumin, OVA),美国 Sigma 公司;兔抗 Notch 1Jagged 1Hes 1、NF - kB 及卩-actin 抗体,羊抗兔 辣根过氧化物酶horseradish peroxidase, HRP)标记二 抗、增强型RIPA蛋白裂解液、彩色预染蛋白Marker (10 ~180 KDa)、PVDF 膜及 SDS - PAGE 凝胶制备试 剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司;Trizol RNA 抽提试剂Easy - LoadPCR Master Mix (Blue, x)、BeyoRTII cDNA第yi链合成试剂盒等 由上海碧云天生物技术有限公司南通分公司提供; PCR实验所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 设计合成。

1.3实验动物分组及处理将SD雄性大鼠随机分为6组每组10只分别为:正常对照组、哮喘模型 组、地塞米松及大豆肽高、中、低剂量组。正常对照组 于实验第1 d和第7 d腹腔注射生理盐水0. 2 ml,其它 各组于实验第1 d和第7 d腹腔注射致敏yeOVA 5 mg +氯氧化铝200 mg +生理盐水1 ml充分混悬)0. 2 ml第8 d,将大鼠置于诱咳引喘仪XR - YLS -8A 多功能诱咳引喘仪,上海欣软信息科技有限公司)中, 正常对照组大鼠用生理盐水进行雾化激发,其它组用 1% OVA生理盐水溶液进行雾化1次/d,每次30 min从雾化第2 d开始,于每次激发前正常对照组和 哮喘模型组灌胃生理盐水,地塞米松组大鼠腹腔注射 地塞米松0. 5 mg/kg,大豆肽组大鼠分别灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,连续激发和给药7 d末次激 发24 h将大鼠麻醉快速取下肺组织收集肺泡灌 洗液,进行白细胞分类计数,然后将肺组织用生理盐 水冲洗干净,取右下叶肺组织用于组织学检测,剩余 组织冻存于-80C超低温冰箱中备用。

1.4大鼠肺组织形态学观察取大鼠右下叶肺组 置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,经系列浓度乙 醇脱水后进行石蜡包埋、切片及HE染色,显微镜下 观察肺组织病理学改变。

1.5 RT - PCR法检测大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平取大鼠左上叶肺 组织约50 ~60 mg,置入盛有液氮的研钵中充分研磨 至粉末状加入1. 5 ml Trizol充分混匀裂解消化12 000 rpm 4C离心20 min,吸取上清根据试剂盒说明 书操作步骤进行RNA抽提和逆转录反应。将逆转录 得到的cDNA进行PCR扩增实验,各待测基因引物序 列见表1。

1.6 Western blot 法检测大鼠肺组织 Notch 1Jagged 1、Hes1NF - kB蛋白表达水平取大鼠左下叶肺 组织约80〜100 mg,剪碎置于离心管中1.5 ml RIPA裂解液于冰上充分匀浆,然后再裂解约30min, 4C 12 000rpm离心15min,取上清移入1.5mlEP管 中,进行蛋白定量,并调整浓度一致。将上清样品与 蛋白上样缓冲液等体积混匀后煮沸5min,以25 ^l/

孔上样进行SDS-PAGE电泳转印至PVDF依 次进行封闭、一抗、二抗孵育、显色及拍照等步骤,以 p - actin 为内参,分析待测蛋白相对表达值。

1.7统计学处理用SPSS18.0统计软件进行数据 处理,数据以Mean 盨D表示,多组间的两两比较采 用单因素方差分析one - way ANOVA)LSD - t 检 验,检验水准为a =0.05。

 

2 # 中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数明显增多

(P<0.001);与哮喘模型组比较,大豆肽600、300 2.1大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的 mg/kg组大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 影响与正常对照组比较,哮喘模型组大鼠BALF 性粒细胞数显著降低P <0.001)结果见表2。

组别

浓度mg/kg)

中性粒细胞107/L)

淋巴细胞107/L)

嗜酸性粒细胞107/L)

正常对照

-

8.04±1.36

19.53?.64

3.53?.45

哮喘模型

-

20.96 ?.53b

45.24 ?.47b

12.09?.69b

地塞米松

0. 5

9.71?.17d

23.72?.55d

4.43?.16ad

大豆肽高剂量

600

11.61?.07c

30.88 ?.89ac

5.61?.40bd

大豆肽中剂量

300

14.11?.47ac

35.98 ?.08bc

7.49?.63bc

大豆肽低剂量

150

18.46?.59b

43.62?.41b

10.49?.80b

F

 

23.267

23.032

49.249

P

 

<0.001

<0.001

<0.001

2大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响x 眘= 10)

注:与正常对照组比较,P <0.05, bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, dP <0.01

 

2.2大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理学变化的影响 增厚,管腔变窄,部分有胶原沉积;大豆肽600、00

正常对照组大鼠肺组织结构完整,肺泡无萎缩塌陷, mg/kg组大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善,炎

气道内壁未见增厚,偶见炎性细胞浸润;哮喘模型组 性细胞浸润减少,肺泡结构较为完整,但仍不能恢复

&:正常对照组沁:哮喘模型组;:地塞米松组;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺组织可见多量、散在的炎性细胞浸润,气道壁 至正常。

1大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理形态的影响X200)

2.3大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平的影响与正常对 照组比较,哮喘模型组大鼠肺组织Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平明显上调P < 0.001);与哮喘模型组比较,大豆肽600 mg/kg组大

鼠肺组织 Notch 1、agged 1、Hes 1 及 NF - kB mRNA 表达水平显者下调P <0. 001)结果见图2、表3。 2.4大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB蛋白表达水平的影响与正常对照 组比较,哮喘模型组大鼠肺组织Notch 1Jagged 1、

Hes 1NF - kB蛋白表达水平明显上调(P < 鼠肺组织Notch 1Jagged 1Hes 1及NF - kB蛋白表

3大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1NF - kB mRNA表达水平的影响(x  s, n = 10)0.001);与哮喘模型组比较,大豆肽600 mg/kg组大 达水平显著下调(P <0.001)。结果见图3、表4。

组别

浓度mg/kg)

Notch 1/ p - actin

Jagged 1/ p - actin

Hes 1/ p - actin

NF - kB / p - actin

正常对照

-

0.167?.029

0.249 ?.035

0.210?.039

0.116?.020

哮喘模型

-

0.458 ?.037b

0.669 ?.050b

0.435 ?.060b

0.805 ?.037b

大豆肽高剂量

600

0.317?.042ac

0.313?.039d

0.291?.018ac

0.564 ?.044bd

F

 

47. 721

88.186

21.273

293.292

P

 

<0.001

<0.001

0. 002

<0.001

注:与正常对照组比较,P <0.05, bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, dP <0.01

 

 

4大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1NF- kB蛋白表达水平的影响(x  s, n = 10)

组别

浓度mg/kg)

Notch 1 /p - actin

Jagged 1 /p - actin

Hes 1 /p - actin

NF - kB / p - actin

正常对照

-

0.189 ?.040

0. 365 ?0. 043

0. 264 ?0. 027

0.258 ?.056

哮喘模型

-

0. 775 ?0. 042b

0.869 ?.047b

0.684 ?.046b

0. 908 ?0. 042b

大豆肽高剂量

600

0.552?.032bd

0.601?.030bd

0.551?.050bc

0.736 ?.058bc

F

 

178. 316

115.681

78. 753

123. 500

P

 

0. 000

0. 000

0. 000

0. 000

注:与正常对照组比较,P <0.05, bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, dP <0.01

3讨论

支气管哮喘是多种炎性细胞浸润或炎症介质参 与的以气道高反应性及重塑为特点,伴有气管痉挛、 呼吸困难、咳嗽及喘息等症状的呼吸系统炎症性疾 病&]。在本研究中,与正常对照组比较,哮喘模型组 大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞 计数明显增多,且HE病理切片观察到气管壁增厚, 管腔变窄,可见多量散在炎性细胞浸润,以上结果与 哮喘的炎症变化及病理学改变相一致,表明OVA致 哮喘大鼠模型成功建立。同时,与哮喘模型组比较,大豆肽600、00 mg/kg可减少哮喘大鼠BALF中中性 粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数,且肺组织病理 学损伤得到明显改善,提示大豆肽可减轻哮喘大鼠气 道炎症,改善肺组织病理性损伤,对哮喘有一定的防 治作用,但大豆肽防治哮喘的具体机制尚不明确。研 究表明,炎症是导致哮喘患者或哮喘动物模型气道增 殖、气管重塑及肺组织损伤等病理变化的重要因素, 控制炎症反应是缓解哮喘症状的重要措施8 ,为此本 研究以 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF - kB _炎症信 号通路为研究靶点,探讨大豆肽抗炎平喘分子机制。

哮喘的发生发展与炎症细胞释放炎性介质(如

IL-lpIL-6TNF-a等)激活Notch 1信号通路 密切相关9 — 10]Notch 1信号通路由其相应的配体 (Jagged 1)、受体(Notch 1)及上下游信号效应分子 (Hes 1、NF - kB)等组成,其调节异常可介导哮喘炎 症的发生,参与气道增殖、气管重塑等病理过程[11]在炎症刺激作用下Jagged 1与Notch 1相互结合, Notch 1 路即被激活高表达 Notch

(notch intracellular domain, NICD)被释放,其下游 Hes 1等关键靶基因被启动从而上调气道上皮胶原蛋白 的表达,诱发气道上皮下增殖和纤维化,引起哮喘气 道重塑等病理性损伤[12-13]NF - kBNotch 1信号 通路调控巨噬细胞介导的炎症反应主要靶分子之一, Notch 1通路活化后,激活I - kB激酶(I - kB kinase, IKK), IKK作用于I - kB使其发生磷酸化,使得NF - kB/ I - kB二聚体复合物解离,NF - kB发生磷酸化 并通过核膜转移进入核内,与DNA特异性结合位点 相互作用,快速启动IL - 6、IL - 5及TNF - a等靶基 因的转录,生成相应的炎症因子促使炎症反应的发 生[14]。同时,生成的炎症因子又是Notch 1和NF - kB 的活化剂,进一步激活 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF -kB信号通路,如此周而复始使炎症反应持续放大 和扩散,使哮喘症状不断加重,诱发气道内皮细胞增 殖和气管重塑等病理性损伤[15]。本研究发现,大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺组织Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表达水平明显下降, 提示其抗炎平喘机制与下调Notch 1/Jagged 1/Hes 1/ NF-kB信号通路有关。

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