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光遗传学技术在脑疾病神经环路研究中的应用(2)
点击次数:172 发布时间:2021-05-06

钙离子成像

光遗传学应用以及成果不仅得益于其核心技 术 ( 微生物视蛋白变体、视蛋白靶向策略、光靶向装置 ) 的发展,也得益于与辅助技术的整合,涉及电生理学、神经元活动成像等数据读取,这样的整合方式赋予了光遗传学在不同时间尺度、不同空间尺度上发挥功能的优势。

近年来,钙离子成像与荧光显微技术作为新兴的脑活动呈现技术得到了快速发展。神经元钙离子成像是目前脑功能研究中观察神经元以及神经环路活动监测的Z常用手段之一。其原理是神经元激活伴随着钙离子进入细胞,与钙离子指示剂结合会出现荧光强度的改变,从而体现神经活动变化,对神经活动可进行长达数月的监测,实现长期体内神经元成像。钙离子指示剂是目前Z常用的基因编辑荧光指示剂,来自于绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP) 或其变异体、钙调蛋白 (calmodulin, CaM)、肌球蛋白轻链激酶 M13 域的融合,其中钙指示剂 GCaMP6 由于超强的敏感度,广泛应用于在体成像研究中。光遗传集成显微系统,整合了光遗传学与钙成像技术,利用单光子成像技术,使用 LED作为光源,将梯度折射率透镜 (gradient refractive index,GRIN) 作为物镜。这种集成显微镜可以在自由活动的老鼠中实现高速大规模纵向记录特定神经元群体的钙离子动态,从而反映神经元与神经环路的活动情况。

新一代光遗传学技术达到了目前研究所需要的高时间、空间、细胞类型分辨率,具备单个神经元与神经纤维分辨率的神经元群体的长期监测能力 ( 表 1) 。

自由活动神经元超微钙离子成像系统 nVista 和 结合光遗传自由活动神经元超微钙离子成像系统nVoke 是目前Z先进的光遗传集成显微系统,在神经环路疾病的研究上具有很大的优势。上述集成系统能够整合光遗传学调控和实时钙离子成像,通过微型植入式探头,在自由活动的动物上长期观察特定神经元群体与脑环路的神经活动,可以实现自动聚焦、精准定位任意目标区域、无需手工调整,最终将同时段的行为学记录、电生理信息、钙离子成像等进行多模态整合,对于参与特定脑疾病神经环路中的细胞进行解析,绘制环路细胞类型与功能图谱,解释特定脑疾病的潜在发病机制。

 

功能和用途

 

1、功能:本仪器是基于多模光纤的微弱荧光信号检测和记录系统,能够稳长时间稳定的激发绿色荧光,并检测荧光信号的微弱变换。

2、用途:用于在体记录动物群体神经元活动钙信号的动态变化,主要用途和特点如下: 

通过光学记录通过遗传手段所确定的特定细胞类型在自然状态下的神经活动;

实时观测动物在进行复杂行为时的神经投射活动;

阐明特殊的神经环路在动物行为中的作用;

检测新型可遗传编码的乙酰胆碱和多巴胺等探针的荧光变化,即可实时监测乙酰胆碱、多巴胺等浓度的动态变化情况;

通过直接观测和投射相关的活动从而在根本上了解以前不可能接触到的神经环路的动态行为;

 
 

 

  • 光遗传学技术的应用

光遗传学技术可以实现在神经元的快速精准控制以及数据读取,极大程度上促进了神经科学发展, 帮助业内学者了解更复杂的神经过程(如学习、睡眠、视觉、成瘾、运动,等 ),对于脑疾病中神经环路的解析具有重要意义,并且有望用于寻找各种神经疾病治疗的新靶点。

脑疾病神经环路研究 神经环路是由一系列相联系的神经元构成的具有明确功能的神经元之间的纤维联系,是大脑神经系统的基本单元。对于脑疾病的理解可以来自于多个层面,从细胞分子水平的微观水平到动物行为的宏观水平,前期的研究主要集中在微观细胞分子水平与宏观动物行为水平。以神经环路为基础的脑功能连接组图谱,对于理解脑功能意义重大,要提高对神经系统疾病的认识,目前急需的是识别潜在的神经环路的异常。脑疾病如阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病 (Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿病 (Huntington’s disease,HD)、癫 等所发生的病理生理变化会影响 正常神经环路的功能,产生相应的临床症状,了解其神经环路的异常变化是理解疾病发生发展机制以及寻找相应治疗方案的必经途径 。

  • AD

AD是老年人中最常见的慢性神经退行性疾病,进行性记忆衰退是疾病特征,患者随后认 知损害更广泛,显著受影响的是学习与记忆神经环路。目前,海马区域的神经环路以及其与前额叶皮质区相互联系是被广泛研究的脑区域。海马结构与前额叶皮质以双向方式相互作用,调节多种认知功能以及处理情绪信息,是大脑记忆系统中极为重要的结构,有助于新信息的快速编码、记忆网络的整合、检索与组织。

发作性记忆进行性丧失是 AD 早期的常见症状,大脑中记忆储存在一群特定神经元 —— 海马印迹细胞中。AD 早期的记忆衰退的机制并不明确,可能是信息编码与整合或是存储与检索神经环路受损。利用新一代光遗传学技术,研究人员发现印迹细胞倾向于通过重复性活动以同步、协调的方式进行工作,不同群体的印迹细胞组成不同类型的同步性活动呈现记忆( 图 3)。通过对 AD 早期转基因小鼠海马区印迹与非印迹细胞进行长时间的区分、监测和调控,发现激活海马印迹细胞可以促使记忆恢复,说明 AD记忆损伤是由于记忆检索提取相关神经环路受损所致,而不是记忆存储的损伤所致。

利用 AD 小鼠模型,研究人员发现在 AD 典型病理变化 β 淀粉样斑块沉积产生之前,小鼠的遗忘呈现出年龄依赖性,与海马齿状回的棘突密度有关。利用新一代光遗传学技术长期刺激齿状回神经元,通过诱导齿状回印迹细胞产生长时程增强,促进棘突密度以及长期记忆的恢复,并且去除这部分印迹细胞可以阻止长期记忆的恢复,提示 AD 早期选择性的挽救恢复印迹细胞的棘突密度可能是治疗记忆丧失的有效靶点。

  • PD

PD 是一种神经退行性疾病,中脑黑质致密部和腹侧被盖区的多巴胺能神经元逐渐死亡是 其病理特征。PD 的主要症状是运动障碍,包括静止性震颤、肌肉僵硬和运动无力。典型发病机制是纹状体功能失调,直接与间接通路功能失衡所致 ( 图4)。涉及的主要神经元为中间棘状神经元 (medium spiny neuron,MSN),主要表达多巴胺 D1 和 D2 两种受体。光遗传学研究提供了纹状体 MSN、中间神经元和传入神经元的详细信息,从而对于 PD 的基 本病理做出了解析。光遗传学在 PD 的运动功能、多巴胺能神经元移植、病理环路研究上得到较多应用,特别是 PD 环路功能失调,是目前的研究热门领域,近年获得了众多进展 ( 表 2)。

  • 癫 癫

是一种由于神经元高兴奋性引起的神经环路兴奋性异常增高,从而出现癫 发作为特征的疾病。以往用于解析癫 神经环路异常的方法包括药物刺激和光刺激释放,这些方法受限于时间分辨率低以及谷氨酸补给。研究人员利用光遗传技术的高时间与空间分辨率对以往存在质疑的失神发作环路进行了研究,发现丘脑皮质神经元的节律同步性脑电波发放以及阶段性发放,对诱发失神发作中的同步尖峰放电波以及行为是必需且充分的。癫 发作严重影响患者生存质量,造成患者认知损害和记忆损伤,前期研究认为可能与海马长期暴露于异常高钙离子浓度下造成的损伤有关。常规技术无法在哺乳类动物海马神经元观察其钙动力学,利用新一代光遗传学技术,研究人员发现不仅在癫发作期间,而且在癫 发作出现以及 EEG 异常之前,海马神经元的钙动力学就出现了明显异常,这种异常发现可以促使研究者抓住癫 发作前的时机从而控制癫 发作。海马神经元内的钙离子水平显著高于正常水平,提示钙兴奋性细胞毒性可能是癫 致认知损害的原因。有趣的是常规抗癫 药物丙戊酸钠并未改变在癫 中所观察到的钙离子动力学的异常。未来可以利用大规模的神经元钙离子成像平台进行新的抗癫药物筛选,为癫 治疗提供新视角。

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