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揭示在自由移动小鼠中睡眠状态与细胞外神经递质变化之间的联系
点击次数:225 发布时间:2020-12-03

一、 介绍

旨在阐明睡眠在哺乳动物中的作用的电生理研究已有近一个世纪的历史,但睡眠的功能仍是一个难以捉摸的谜。睡眠状态活动的歧视取决于对自由活动的动物的脑电图(EEG)和肌电图(EMG)信号的准确确定。脑的EEG记录可提供有关神经元活动的大量信息,但局限性在于这些测量仅报告了总体的神经元放电模式。了解驱动这些大规模神经元事件的潜在生理机制,需要能够准确监控神经化学物质释放和摄取的技术。这样的技术可以针对大脑中的特定结构,以补充电生理-临床研究,现已被认为是研究睡眠作用的重要组成部分。

准确确定睡眠状态的主要方法需要同时记录大脑皮质区域的EEG记录和肌肉EMG活性的同时测量。脑电图痕迹反映了植入颅骨的两个独立电极之间的微伏电位差。潜在的大小差异为50至200 lV神经元放电引起的膜电位变化的结果活动。脑电信号的频率也反映了神经元的活动。高频(> 12 Hz)脑电图表明活跃,完全不同的神经元激活通常与清醒有关。高放大器波形(> 100 lV),低频(<5 Hz)脑电活动,例如在慢波(SW)睡眠期间观察到的现象表示皮层神经rons以高度同步的节奏射击。脑电图具有5-8 Hz的频率,其幅度小于100 lV,通常表现为快速眼动(REM)睡眠。肌电图激活通过在肌肉中放置两个独立的电极进行测量,可以反映神经元激活产生的电位与肌肉收缩有关。高振幅肌电图反映活动运动,而强音肌电图信号表明静止或睡眠。

尽管测量大脑和肌肉的电活动可以指示睡眠状态,但不能提供神经化学功能的指示。要更好地了解渗透生理,就需要同时测量EEG记录旁的神经递质活性。L-谷氨酸,大脑中醉丰fu的兴奋性神经递质,据信在睡眠过程中起着重要但尚未定义的作用。先前的大鼠研究表明,睡眠状态之间的L-谷氨酸水平发生了变化REM睡眠过程中前额叶皮层区域的细胞外L-谷氨酸浓度增加。

量化与睡眠同时发生的时间的函数的神经递质浓度并非易事。传统上,这种采样是通过微透析完成的或验尸技术,例如免疫组织化学 或放射自显影。这些技术中的每一个都可以提供有用的数据,但是所有这些技术都有类似的局限性,包括无法实时监视神经递质(例如缺乏时间分辨率),以及正在监视的空间的新生平衡(局部环境)受到干扰。例如,微透析可提供数小时或数天的采样,但通常仅限于每个样品不超过1-5分钟的速率。在微透析过程中,从当地环境中去除分析物会扰乱自然平衡,并且样品的采集后处理非常费力。验尸技术的局限性在于每只动物只能产生一个可用的时间点,而牺牲的必要步骤会干扰睡眠的测量[8b]。也尝试过将非侵入性技术(例如MRI)与EEG记录同时使用,但是这些技术要求动物在整个采样期间保持固定状态。

同时测量脑电图,肌电图和L-谷氨酸生物传感器的记录非常适合量化睡眠过程中神经递质释放的每秒变化,而不会干扰局部环境的平衡。生物传感器采用生物识别元件(通常是酶)来产生电活性物质,然后在转导元件上将其氧化。在L-谷氨酸生物传感器的情况下,极化至0.6 V的Pt-Ir电极涂在含有生物元素L-谷氨酸氧化酶的基质中。生物传感器周围细胞外空间中的谷氨酸盐被L-谷氨酸氧化酶转化为过氧化氢(H2O2)。酶产生的H2O2然后通过各种膜层扩散到Pt–Ir表面,在此被氧化,产生可测量的安培电流。

睡眠剥夺仪  型号:XR-XS108

近的研究强调了在大鼠模型中结合EEG和EMG记录以及同时进行生物传感器测量的有效性。这些研究报告了苏醒期间谷氨酸能活动的升高和REM睡眠发作期间谷氨酸水平的显着升高。无一例外,所有这些研究都是使用大鼠作为模型生物进行的。由于大鼠的体型大,它对生理学研究是有利的,但是这些研究的结果很难用于基础遗传学。凭借其作为遗传模型的用途,小鼠是研究睡眠的强大得多的手段。

二、实验前期准备

小鼠在手术前至少12小时光照12小时黑暗周期(LD 12:12)下饲养。在整个实验中,所有小鼠均保持在LD 12:12,食物和水可自由饮用。

三、手术方法

使用氯an酮(100 mg/kg))甲苯噻嗪(10 mg/kg)对小鼠进行麻醉,并通过外科手术植入电极进行EEG和EMG记录。将一根带有金属丝的不锈钢螺钉放置在额骨区域(A/P -1.0 mm,M/L-1.5毫米)和两根带电线的螺钉置于后脑上方(A/P:3.0毫米,M/L±1.5毫米)。使用双Pt-Ir电极监测EMG活性,该电极部分涂有特氟隆,两侧插入颈背区域(颈部)肌肉。所有电极引线均连接至预制的头戴式支架,并用牙科丙烯酸酯密封树脂。

四、EEG/GEMG数据收集

提供了一个预放大器单元,牢固地连接到鼠标头枕上第yi级放大(100*)和初始高通滤波(对于EEG,一阶0.5 Hz,对于EMG是10 Hz)。然后将信号通过系链和低扭矩换向器连接到上海欣软信息科技有限公司的脑电肌电采集系统。放大器调节单元提供了额外的50信号放大,额外的高通滤波和8阶椭圆低通滤波器(50 Hz EEG和200 Hz EMG)。然后,以500 Hz采样信号,使用14位AAD转换器将其数字化,然后通过USB路由至基于PC的采集和分析软件包。从本质上讲,小鼠是夜行性动物,其昼夜节律使得在“熄灯”期间可以观察到大多数唤醒活动。通常在“开灯”期间观察到睡眠,尤其是REM睡眠。在“熄灯”期开始后连续收集了EEG,EMG信号。实验的前12小时(“熄灯”)专门用于传感器磨合和建立稳定的生物传感器信号。在接下来的12小时内(“点亮”),对应于SW和REM睡眠量多的时期,收集了EEG,EMG数据进行分析。

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