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大小鼠新物体识别实验方法及注意事项三部曲(2)
点击次数:862 发布时间:2021-12-09

摘要

新物体识别测试(ORT)是一种常用的行为分析方法,也称作新物体识别测试,用于研究小鼠学习和记忆的各个方面。ORT比较简单,可以在3天内完成:习惯期、训练期和测试期。在训练期间,小鼠可以探索两个相同的物体。在测试期,将一个训练期的物体替换为一个新物体。因为小鼠有一种天生的对新奇事物的偏好,如果小鼠识别了熟悉的物体,它就会把大部分时间花在新物体上。由于这种天生的偏好,不需要积极或者消极地强化训练或长时间培训。此外,ORT还可以被许多应用领域应用改良。比如记忆间隔可以缩短,用来检查短期记忆,也可以延长,用来检查长期记忆。药理学干预可用在训练前、训练后或回忆前的不同时间段内,用来调查学习的不同阶段(即习得、早期或晚期巩固或回忆)。总的来说,ORT是一种相对压力低且有效的小鼠记忆测试,适用于检测药理学、生物学或遗传操作后的神经心理变化。


介绍

物体识别测试(ORT),,是一种快速有效的测试小鼠不同阶段学习和记忆的方法。它最初是在1988年由Ennaceur和Delacour提出的,主要用于大鼠; 然而当时它也被成功地用于小鼠测试。这个测试只需要三个阶段:习惯期、训练期和测试期。训练期只是对两个相同物体的视觉探索,而测试期会用一个新物体替换之前已探索的物体之一。因为啮齿动物对新奇事物有天生的偏好,啮齿动物记住熟悉物体的情况下,会花更多的时间探索新物体。

ORT相对于其他啮齿类动物记忆测试的主要优势:它依赖于啮齿类动物探索新奇事物的自然倾向。因此,不需要大量的培训课程或任何积极或消极的强化来激励促进。与其他测试相比,ORT的压力要小得多,而且比Morris水迷宫或Barnes迷宫等常用的记忆测试所需时间要少, 这两种测试都需要一周甚至更长时间。因此,ORT与许多其他啮齿类动物记忆测试相比,ORT测试条件更接近于目前研究已认知的条件,增加了该测试的生态学正确性。类似地,由于ORT是一种简单的视觉回忆任务,它已被成功地用于许多物种,包括人类和非人类灵长类动物,用来评估不同物种间的陈述性记忆不同面。最后,ORT可以很容易地进行修改,应用在检查学习和记忆的不同阶段(如获取、巩固或回忆),评估不同类型的记忆(如空间记忆),或评估不同的保持间隔(如短期记忆vs长期记忆)。

ORT的通用性为无数的研究应用提供了一个平台。研究可以利用药物来干扰或增强记忆。在训练前、训练后或测试前改变给药时间,可以暗示导致记忆中断或增强的潜在神经机制。类似地,光遗传技术可以在这些相同的或不同的时间点上进行观察神经激活/抑制,这样助于学习和记忆的不同阶段。ORT也适用于评估转基因动物、损伤研究、神经退行性模型或衰老研究中的差异。训练和测试之间的时间被称为记忆保持间隔,可以通过记忆保持间隔的变化来评估短期和长期记忆的变化。最后,ORT可以作为研究学习和记忆的药理学、遗传学和神经学变化的工具,或者这些工具用作研究ORT学习和记忆的基础。

实验操作

一. 物体选择和实验设置

1. 选择不同的物体(需要很容易被小鼠识别),但也要有相似的复杂性(纹理,形状,颜色图案和正确性等),最小化任何潜在的可能因素,否则导致结果偏差。

1.1 测试天生偏好和辨别能力(见步骤2和3)。

1.2 使用和小鼠差不多大的物体或略大的物体,减少诱导偏好,促进探索(图1), 确保小鼠能够爬上两个物体或两个都爬不上(只能爬上一个物体可能会增加探索的兴趣,且爬在一个物体的时间不计入探索时间)。

1.3 每个物体至少有两个备品。为了尽量减少测试过程中潜在的气味线索,每个物体至少有3个备品,一个用于训练,一个用于测试。

1.4 使用不易碎材料制成的物品,因为在实验过程中物体损坏而丢失的物品可能会干扰试验的连续性,并可能对动物造成伤害。

1.5 在使用前和使用时彻底清洁物品(以70%的乙醇为宜)

2. 为了减少明亮照明的影响,使用扩散的低照明设备,迷宫的中心照明约20lux。使用温度和湿度相同的房间条件,如果小鼠被从一个房间转移到另一个房间进行实验,每天使用前至少要让小鼠适应新房间1小时。

3. 在训练前做好对小鼠的抚摸。因为这个测试依赖于啮齿类动物探索新奇事物的自然倾向,所以要减少任何压力或焦虑,否则这些压力或焦虑可能会干扰它们的探索,以及随后探索物体的yu望。理想情况下,在试验前1~2周,每天抚摸小鼠1~2次,每次至少1分钟。

4. 测试箱使用一个正方形的箱体(约40厘米× 40厘米× 40厘米,也可以进行适当的调节修改),由白色或黑色的无孔塑料制成,与小鼠的颜色形成对比。或使用一个圆形的测试箱,因为相较于方形测试箱,圆形测试箱可能更适合促进探索行为——焦虑的小鼠可能会趴在一个方形测试箱的角落里,圆形测试箱可能更适合促进探索行为.

4.1 在训练期时,将两个相同的物体放在对角线上(即一个在西北角,一个在东南角)。如果物体太轻,小鼠能够移动物体,可以把物体固定在底板上,可拆卸安装的胶体将之粘贴在底座上的效果就很好。

4.2 在测试期时,使用每个物体的第三个备品,将一个熟悉的物体和一个新物体放在与训练时相同的对角线上(图2)。

4.3 平衡每组物体的分配使用,熟悉物体和新物体同时换组使用。在物体在测试箱的四个角落的位置要相同,并且一定要注意哪条对角线用于哪只动物,以便每只小鼠在训练时使用的对角线与在测试时使用的对角线相同。

4.4 在使用前和使用时彻底清洁设备和物体以去除气味(以70%的乙醇为宜)

5. 将相机安装在测试箱上方,以获得最佳的探索视角。为了准确分析,只使用带有鼻尖检测的软件。使用软件在开始拍摄前,先拍摄背景图像,并将物体放置到位。在软件中,将探测区域设置为物体周围约2~3厘米。


6. 实验需要记录下这个试验,然后给它打分。为了减少实验者的干扰,要让实验者在小鼠看不见的地方。如果在实验过程中进行手动评分,请确保实验者距离测试箱1米以上,并且小鼠无法看到实验员。

注意:任何时候小鼠停留在物体上而不主动进行触须扫瞄或嗅探都不能算作探索时间。

7. 将探索定义为当小鼠的鼻尖指向目标物体,并且在距离目标2~3厘米的范围内,用主动的触须扫瞄或嗅探。不计算任何没有积极探索性质的爬在物体上的时间。

二. 必要的试点实验

1.1 为了小鼠能够适应,把小鼠从笼子里拿出来,并把它放在旷场(测试箱)的中间。允许小鼠自由探索5分钟。

1.2 在训练期内,在测试箱的对角线放置2个不同的物体(即西北和东南角)。把小鼠从它的笼子里拿出来,放在旷场(测试箱)的中央。允许自由探索10分钟。

1.3 计算识别指数。如果没有诱导偏好,则识别指数应在零或接近零。任何显示优先级的物体都不要应用于ORT。

2. 识别能力测验

2.1. 为了小鼠能够适应,把小鼠从笼子里拿出来,并把它放在旷场(测试箱)的中间。允许小鼠自由探索5分钟。

2.2 在训练阶段(T1)中,将2个相同的物体放在对角线位置。将小鼠放在测试箱中心,允许小鼠探索10分钟。

2.3 在测试阶段(T2),将T1期间熟悉的物体备品和一个新物体放在对角线位置(即西北角和东南角)。

T1后60分钟,将小鼠放在测试箱中心,允许自由探索10分钟。

2.4 计算识别指数, 在保持间隔60分钟时,鉴别指数应高于0.25。

三. 实验的程序


1.1 把小鼠从它的笼子里拿出来,放在旷场(测试箱)的中间。允许小鼠自由探索5分钟。笼子如果使用过一遍,就把它留作第二天用的笼子。

1.2 5分钟后,取出小鼠并放入笼中。不要将小鼠放回原来的笼子,否则可能影响其余待测试小鼠的行为。

1.3用70%的乙醇彻底清洁小鼠的设备。

注意:在习惯化期间,可以通过计算小鼠在旷场中心花费的时间来评估类似焦虑的行为

T1的时间长度时是一个有用的度量,高焦虑的小鼠可能需要10分钟的时间来达到最di勘探准则。

2. 训练期(T1)

2.1 将两个相同的物体放置在测试箱对角线的位置(即东北角和西南角)。

2.2 习惯化24小时后,将小鼠从鼠笼中取出,置于测试箱中心,与两个相同的物体保持等距离。

2.3 允许自由探索至少5分钟。如果使用一只低活动量或探索量的小鼠(如大多数小鼠没有在5分钟内探索两个物体各20s, 同样适用于试点实验), 那么就扩展队列中所有小鼠的试验到10分钟。

2.4 试验结束时,将小鼠移出并放入笼中。笼子如果使用过一遍,就把它留作测试时的笼舍。

2.5 用70%乙醇彻底清洁小鼠的设备和物体。

3.测试期(T2)

3.1 将T1期间使用的一个物体(熟悉的物体)和一个新物体放在测试箱对角线的位置。对每个小鼠都使用它们在T1期间相同的物体位置。

3.2 在T1到T2的选择间隔时间内,将小鼠从笼子中取出,并将它放在测试箱中心,保持和两个物体的距离等距。

注:在24小时的保留间隔中,大多数小鼠将无法区分熟悉的和新的物体(通常-0.2 < d2 < 0作为可信的控制度),如果测试益智作用,使用这个时间点来探测记忆增强。为了检测记忆缺陷,根据小鼠的不同,使用20分钟到4小时的较短的记忆间隔。

3.3 允许自由探索10分钟。试验结束后,将小鼠移出并放入笼中。

3.4 T1和T2都在前面5分钟评分。如果小鼠没有达到对两个物体的最小20秒的探索时间,超过5分钟继续评分,直到总探索时间超过20秒。

四. 数据分析

1. 排除标准

1.1 在训练(T1)和测试(T2)期间,计算每个期间(e1和e2)中两个的物体总探索时间。大多数小鼠两个目标的最小探索时间应该是在5分钟内达到20秒

1.2 对于探索程度低且不满足最di标准的品系,将T1和T2时间延长至10 min,可以在试点测试期间观察到。

1.3 评分达到5分钟或5分钟以上,直到达到20秒的最di标准。

1.4. 如果小鼠在T1或T2时间10分钟内对两个物体的探索都没有达到20秒的最di时间,则排除在分析之外,因为无法确定它们是否花了足够的时间来学习/辨别。

2. 绝对分析与相对分析

注:不同的分析公式及其相互关系见表1。

2.1 计算e1为2个相同物体训练时的总探索时间,其中a1和a2为相同物体。

E1 = a1 + a2

2.2 计算e2为测试熟悉物体(a)和新物体(b)的总探索时间。

e2 = a + b

2.3 d1简单地计算为探索新物体所花费的时间减去探索熟悉物体所花费的时间。绝对鉴别测量(d1)没有考虑小鼠或治疗组之间探索时间的差异,尽管在某些情况下,它可能是一个更敏感的测量2。

d1 = b

2.4 d2是探索新物体所花费的时间减去探索熟悉物体所花费的时间除以总探索时间。zui常用的测量方法是相对判别值,通常称为判别指数(d2),不受探测时间差异的影响。所有的值都在-1和+1之间。

d2 = d1 / e2

2.5 或者,计算识别或偏好指数(d3)。这是花在探索新事物上的时间除以总时间。所有的值都在0和1之间,通常乘以100,用作百分比值。

d3 = b / e2 * 100

3. 统计分析

1. 使用每组的平均判别值进行单向方差分析,确定记忆性能。为了进一步分析,事后对治疗组与载体组以及阳性/阴性对照组进行双向比较。

代表性成果

图2显示了ORT的一般实验设置。在习惯期(T0)小鼠被放置在旷场环境5分钟。24小时后,小鼠被放置在两个相同的物体的测试箱内,允许自由探索长达10分钟(T1)。在测试期(T2),小鼠再次被放置在测试箱,但有一个熟悉的物体和一个新的物体,并允许探索长达10分钟。T1和T2之间的停留时间间隔,可以根据实验的最终目标而改变。在有代表性的数据中,因为抑制剂有望增强记忆的影响,所以经药物处理的小鼠在T1后24小时内被测试应该没有区别。

磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase 2)抑制剂已被证明可以增强ORT中的学习和记忆。与之相比,PDE2抑制剂Bay 60-7550或ND7001在训练前30分钟给予以剂量依赖性的方式显著记忆增强(图3a和3b)。在训练和测试的不同时间点给药时,在训练前30分钟、训练后立即和回忆前30分钟给予给予 PDE2 抑制剂 Bay 60-7550 记忆明显增强(图 4a 和 4b)。这表明PDE2抑制增强了习得或早期巩固机制以及回忆过程中的记忆。(本实验选用6 ~ 8周龄的实验未成熟雄性ICR小鼠。)

在实验设计时,必须考虑许多因素。小鼠的品种对探索时间和积极物体识别的保留时间都有很大的影响。Sık及其同事分析了一些常用的品系,包括C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠。结果表明,各品系总探查时间有统计学意义上的差异,其中Swiss和Balb/c的探查时间最长,C57BL和129/sv的探查时间最短。这会影响绝对区分值(d1)。此外,随着时间的推移,保留时间显著减少,129/Sv小鼠在1 h时d2值最di(图5)。对于129/Sv品系,这可能是由于它们的探索水平较低,不一定是缺乏识别。值得注意的是,在本研究中,研究人员使用了较短的T1和T2(每次试验3 min),这导致4个品系中只有2个品系达到了本文建议的最小20 s的探索时间。通常这个最小标准被认为是学习和探索对象所需的最小时间。这里引用的研究,证明了拥有这样一个最di标准的重要性。


图1:在ORT中使用的样本物体。Lueptow等人使用的物体很简单,但有几个明显的特征。所有的物体都比普通小鼠稍大一点,可以很容易地爬上去。从左到右依次是一个倒置的酒杯,一个带胶带的玩具积木,一个冰袋,一个有突出的眼睛的玩具积木。可拆卸胶体的将物体粘在底板上,以免在探索过程中移动或倾倒。


图2:ORT的实验设计,ORT实验通常持续3天以上。第一天是习惯化(T0),允许小鼠在开旷箱中探索5分钟。第2天是训练(T1),小鼠沿着对角线放置2个相同的物体去探索测试箱。测试(T2)在T1后24小时进行(根据实验条件,间隔时间可以缩短或延长)。小鼠沿着对角线放置一个熟悉的物体和一个新奇的物体来探索测试箱。


图3:ORT剂量依赖性记忆增强。(a) Bay 607550和(b) ND7001,当训练前30分钟给予时,以剂量依赖的方式改善记忆,从识别指数(d2)的增加可以看出。条形代表平均值±S.E.M.; N = 每组10-18。相较于载体小鼠p = 0.05, *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001.


图4:习得、早期巩固或回忆过程中的PDE2抑制剂显著增强ORT中的记忆。(a) 607550 Bay (3 mg/kg)在训练(习得)前30分钟给予,显著增强记忆。(b)在训练(巩固)后立即或测试(回忆)前30分钟给予607550 Bay (3 mg/kg)显著增强记忆,从识别指数(d2)的增加可以看出。条形代表平均值±S.E.M. N = 每组10-18。相较于载体小鼠p = 0.05, *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001.


图5:品种不同的小鼠保持不同的时间间隔,C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠在不同时间间隔条件下的物体识别任务中相对识别指数d2的表现。所有的品种在间隔1小时时区分不同的物体,但在间隔4小时和24小时时不区分。值代表平均值(±S.E.M.)。虚线之间的区域表示虚组的s.e.m.范围(均值:0,s.e.m.: 0.06)。

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