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光遗传学技术在脑疾病神经环路研究中的应用(1)
点击次数:176 发布时间:2021-04-12

1、光遗传学(optogenetics)技术

1.1 光遗传学技术 脑科学研究工具的基本功能是记录神经元的活动与调控。随着成像技术的发展,神经活动记录目前已经实现了从宏观记录到微观记录的演变,功能磁共振成像 (functional MRI,fMRI)、正电子成像 (positron emission tomography, PET)、脑电图 (electroencephalography,EEG)、神经元钙成像技术 (calcium imaging) 等可以在不同微观层面上显示神经元活动,单光子及双光子显微镜的出现使得对神经元的观察可以细致到单个神经元甚至是细胞亚结构如突触水平。在神经元调控层面, 传统的调控方式包括细胞外电生理刺激、药物干预和基因编辑,等。电刺激是Z常用的神经元调控手段, 具有较高的时间准确性,但细胞特异性低。其他方式如药物干预或者基因编辑,可以精que到特殊类型细胞,但时间分辨率较低。因此,早期的脑功能研究工具尚不能兼顾高时间分辨率、高空间分辨率和细胞类型高分辨率。理想的脑科学研究工具需要兼顾这 3 种分辨率需求,特别是目前对于脑功能连接网络的研究,急需单个神经元和神经纤维分辨率下的神经元群体的长期调控与观察,这就需要突破现有脑功能研究工具的技术瓶颈。

光遗传学是将遗传学与光学相结合的新技术,使用遗传学手段,常以病毒或者使用转基因动物为载体, 将光敏蛋白基因导入到目标细胞中,细胞表达光敏感蛋白,之后利用光学调控细胞活动,光遗传学的本质是将遗传学与光学方法相结合从而使活体中特定细胞获得或失去特定的功能。

光遗传学的应用与发展实现了神经科学家用光照控制神经元活动的设想,结合成像等辅助技术, 具有高时间特异性、高空间特异性以及高细胞类型特异性进行神经元调控的特性,从各个层面上进行脑科学研究 。

1.2 光遗传学技术的原理与应用方法   光遗传学技术是遗传学与光学技术的结合,利用遗传学手段, 将光敏感蛋白导入至目标细胞中,之后利用光学手段刺激目标细胞从而实现细胞功能的控制。光遗传学技术的 6个简要步骤。

首先是在目标神经元中表达光敏蛋白 —— 视蛋白。视蛋白是光遗传学中使用z广泛的执行元件, 是光敏感膜蛋白在受到特定频率的光线照射后可以实现暂时的构象变化、执行功能。根据视蛋白种类的不同,可以实现神经元的激活或者抑制。实现光敏蛋白在目标细胞的表达:

①构建遗传学元件。

② 选用合适的载体将遗传学元件导入目的细胞进行基因改造,常用由病毒、转基因动物或者两者相结合的方式来实现的。转基因动物结合病毒载体注射的方式可以更好的实现光敏蛋白表达的细胞类型与空间特异性,是目前z广泛使用的方法,比如 Cre 重组酶小鼠结合病毒载体导入。

③将构建好的病毒载体注射到目的脑区使其在目标神经元表达。这些基因产物感应光照后,产生相应的构象改变,作为光敏感离子通道或离子泵等工作元件而发挥作用,发挥蛋白功能、调控细胞活动 。

④光源调控元件植入目标部位。常用的“光电极”是光纤结合电极将光源的传递与电生理记录整合到一个装置中,从而实现在使用光源控制神经元活动的同时进行神经活动的电生理记录。

⑤选择特定波长的光源进行目标细胞的活动干预,常用的光源有激光、发光二极管 (light-emitting diodes,LED)。激光光源优势在于可以使用波段较短的光,实现不同类型视蛋白的控制,并且可以与光纤有效结合,便于脑深部的光源导入,脑损伤较小。LED 优势在于价钱更低,以及具有较多的光源颜色的选择,可以实现多位点发光以及制作成无线移动装置 。⑥实验过程中输出数据的读取与分析,涉及到光遗传学各种辅助技术的快速发展。

摘要 光遗传学广义上是借助光感靶向控制工具向效应细胞传递不同功能的研究工具。在神经科学研究中,科学家可以利用光学手段调控特定神经元亚群(甚至单个神经元)的电活动,研究生理和病理情况下神经环路的功能和潜在调控机制。光遗传结合钙离子成像技术,可以在生理调控的基础上实现实时观测神经元的响应活动,有助于从多个维度定位特定功能的神经元集群,进一步揭示其在神经环路中的具体作用,用于解释脑疾病对整体脑功能网络的影响,帮助临床医生更好地理解帕金森病、阿尔茨海默病、癫 等神经环路疾病的发病机制,找到潜在的治疗靶点,改善患者的临床预后。

光遗传学技术可以与多种数据读取方式相结合。电生理信号的读取是Z常用的方式之一,如光电极, 可以在自由活动动物身上实现多个位点的电生理记录,具有较高的时间与空间分辨率,但是细胞类型分辨率较低。采用fMRI 可以从宏观上对于脑功能的变化进行提示,也是数据读取方式之一,但其时间、空间、细胞类型分辨率都较低。光学信号读取具有更好的空间分辨率以及细胞类型信息。基于染料的成像已经用于各种光遗传学研究,使用钙离子染料、电压敏感染料可以实现神经元活动的可视化 。神经元钙成像是近年来快速发展的光遗传学数据读取的有效方式。

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