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揭示跳台实验反射法耳鸣动物行为学模型的建立机制
点击次数:247 发布时间:2020-12-30

目的 

建立跳台反射法耳鸣动物行为学模型,丰富动物耳鸣的建模方法。

方法 

Wistar大鼠20只,随机平均分为2组:水杨酸组和对照组(每日分别经腹腔注射10 %水杨酸钠350 mg/kg/天和生理盐水)。动物于隔音室内进行条件反射训练。经10~14天的强化训练后,动物形成“声刺激-跳台逃避”的条件反射。条件反射建立后动物给药,分别记录两组动物在给声期间及刺激间期跳上跳台的次数。结果 水杨酸组动物给药后每10次刺激间期中出现的跳台动作为(3.9±1.6)次,经方差分析,与对照组存在显著性差异(P<0.05),说明大鼠经注射水杨酸钠后有耳鸣的产生。

结论 

跳台法耳鸣动物模型可有效验证水杨酸动物耳鸣的产生,可为耳鸣的基础研究提供一种理想模型。

 

耳鸣为耳科常见病,据英国的一项调查研究显示,在成年人中,大约有10%的人曾患有持续性自发性耳鸣(prolonged spontaneous tinnitus),其中约1%的患者因严重的耳鸣而产生烦躁、焦虑和抑郁等症状,严重影响日常生活和工作。约2.5%的成年人因耳鸣症状曾入院治疗。长期以来,由于缺少有效的动物耳鸣疾病模型,使得人们对耳鸣发生机理的研究进展缓慢,从而大大制约了耳鸣的治疗进展。由于动物无法像人类那样通过语言来描述耳鸣的产生,所以建立某种条件反射,通过对动物行为的观察来间接判断动物耳鸣的产生就成为建立耳鸣动物模型的基本原理。1988年Jastreboff等通过饮水抑制法,提出了Di一个经典的急性水杨酸盐耳鸣动物模型,使人们能够深入研究耳鸣的发生机制和治疗。2003年Guitton等对大鼠耳鸣的研究中利用跳台反射的方法,通过建立一种“声音刺激-电击-逃避反应”的行为模式来观察动物耳鸣,同样也取得了较好的效果。本研究的目的是参考Guitton等的方法并加以适当改进,建立跳台法耳鸣动物行为学模型,提供另一种有效的耳鸣建模方法。

 

1.1 动物  健康雄性白色Wistar大鼠20只,由北京维通利华实验动物中心提供,并于北京大学医学部动物实验中心饲养。所有动物耳道清洁,耳廓反射灵敏,对电刺激反应敏感,体重285 g~468 g,平均354 g。

1.2  主要试剂与仪器 水杨酸钠(sodium salicylate,美国Sigma公司);屏蔽训练箱(自制);大鼠跳台仪(上海欣软信息科技有限公司,XR-3TD型);飞乐牌扬声器(YD-2502型,8Ω);音频信号发生器(GW GFG-8016D型);功率放大器(红岩牌HY5885A-400型);示波器(ARON-BS5504型);力盾牌数字时间继电器(JS48S-S型)。

1.3 方法

 

1.3.1 动物分组 将动物平均随机分为2组,第1组为水杨酸组,第2组为对照组,每组10只。

 

1.3.2 建立条件反射  动物于隔音室内适应性分笼喂养,每笼4只。室内温度恒定控制在25℃,人工控制照明12小时灯光开/关使动物的昼夜节律保持稳定,饮食及饮水充足,一直到实验结束。

 

条件反射训练于另一隔音室内进行,各频率背景噪声均<25 dB SPL,每只动物均单独进行训练。动物置于自制的屏蔽训练箱内,箱顶扬声器给予10kHz,60 dB SPL的外界声刺激作为条件刺激,持续时间为10秒,非条件刺激为动物足底电击(5mA),持续时间8秒,条件刺激和非条件刺激出现的时间间隔为2秒。训练动物当听到声刺激信号后,因足底受到电击而产生向箱内绝缘跳台跳跃的逃避反应。每次训练的间隔期为3分钟。每只动物每天连续训练10次为一个训练系列。记录动物在给声期间及刺激间期的行为反应,正确反应率为给声期间动物正确跳上跳台的百分率。经过4~5天的适应性训练,动物开始学会建立“声刺激-跳台逃避”的条件反射,连续4天未学会跳台逃避的动物即被淘汰。再经过7~10天的强化训练,使此条件反射加强并稳定。当每只动物至少在连续3个训练系列中对声音的正确反应率均≥80%,即可判定为条件反射建立成功。

隔音箱+跳台箱,型号:XR-3TB

1.3.3 行为监测 当动物条件反射建立成功后,即进入实验观察期,观察药物对动物行为反应的影响。此阶段的动物行为观测指标为:①正确反应率,为外界给声时动物正确跳上跳台的百分率;②假阳性反应,为每个训练系列中动物在刺激间期的前1分钟内跳上跳台的次数。足底电击只在声刺激后动物未能正确跳上跳台时随机给予。刺激间期动物若在跳台上停留时间超过10秒,则人工将动物取下。整个行为监测分为3个阶段,给药前期(1~2天)。给药期(3~6天):水杨酸组动物每日经腹腔注射10%水杨酸钠350 mg/kg,对照组每日经腹腔注射生理盐水350mg/kg。所有动物均连续给药4天,并于每次给药后2小时进行动物行为测试,记录动物行为反应指标的变化。停药期(7~11天):两组动物分别停止应用水杨酸钠和生理盐水,连续记录停药5天的动物行为反应指标。

 

1.3.4 统计分析  所有实验数据均经SPSS 12.0统计软件处理,对实验结果进行双因素方差分析。第1组动物注射水杨酸钠(3~6天)后2小时对声音的正确反应率为(86.8±3.3)%,与给药前相比(91.9±0.8)%,曲线呈轻度下降(P<0.05),停药后逐渐恢复至给药前水平(图1)。第1组动物在给药期的假阳性反应为(3.9±1.6)次,曲线较给药前上升明显(图2)。与对照组动物相比,动物注射水杨酸后假阳性反应明显增加,经方差分析,二者存在显著性差(P<0.05)。对照组动物各期之间的行为学指标无显著性差异(P>0.05)。结果证明,水杨酸组动物确实感觉到了耳鸣的存在。在声刺激的间隔期,尽管没有外界声刺激存在,但动物因感受到了耳鸣信号,从而诱发了对电击的恐惧反应,导致出现跳台动作,假阳性反应明显增加。

 

3. 讨论

水杨酸类药物对人体具有明显的耳毒性作用,长期大剂量使用会导致耳鸣、听力下降,停药后症状逐渐消失。临床观察听力正常者长期服用大剂量(>350 mg/kg)水杨酸盐后,几乎100%有不同程度耳鸣产生。其血药浓度于1~1.5小时后达峰值。由于水杨酸盐具有引起耳鸣的成功率高、操作简单、全身副作用小等优点,因此,经水杨酸盐诱导建立的耳鸣动物模型是目前Z常用、有效的建模方法。1994年Jastreboff等利用饮水抑制方法,首次成功设计出一套完整的经水杨酸盐诱导的动物急性耳鸣行为学模型,并通过试验测得水杨酸钠引起的耳鸣在声音特性上与10 kHz,70 dB的纯音基本一致。

 

耳鸣动物模型设计的基本原理是建立某种与耳鸣信号相关的条件反射,通过动物的行为学指标对动物有无耳鸣加以判断。根据经典条件反射和操作性条件反射的原理,形成条件反射的基本条件就是条件刺激与非条件刺激在时间上的结合,这个过程称为强化。一般来说,一切来自体内外的有效刺激只要跟非条件刺激在时间上结合(即强化),都可以成为条件刺激,形成条件反射,例如食物性条件反射、防御性条件反射等。基于以上原理,2003年Guitton等利用跳台法建立的耳鸣动物模型同样取得了令人满意的结果。本模型通过将“声刺激”和“电击-跳台反应”在时间上进行结合、加强并终使动物建立“声刺激-跳台逃避行为”的条件反射。条件反射建立后,动物对声音(10 kHz,60 dB SPL)反应敏感,并且通过7~10天的条件强化,动物对此条件反射的记忆时间较长,平均在6~7天内对声音的正确反应率可维持在80%以上,因此较为适合实验周期相对较长的耳鸣实验。另外,与饮水抑制法相比,此模型还具有在实验过程中对动物的全身状态影响较小的优点,因此较适合应用于实验中对动物身体状态有特殊要求的情况,如实验中对耳鸣动物进行的手术干预等。

 

本实验采用Guitton等创立的跳台法建立耳鸣动物模型,并对其训练方法加以如下改进:

①针对文献报道的条件声刺激持续3秒,条件刺激结束1秒后给予30秒的非条件刺激的方式,考虑到耳鸣为持续性信号的特点,我们将条件声刺激增加为10秒,以使外界声信号与耳鸣的存在形式更为相似。非条件刺激时间持续8秒,使动物在接受电击的同时始终有声刺激的存在。

②文献要求在条件刺激结束1秒后给予非条件刺激,但实验过程中发现动物较难在1秒内对声音作出正确反应,我们将非条件刺激改为在条件刺激结束2秒后给予,取得良好效果。

③文献中每次条件训练的间隔期为1分钟,我们在实验中发现,训练间隔期过短往往会造成动物对条件反射的过度强化,动物在间隔期没有声刺激的情况下后仍然出现频繁的跳台行为,导致正常状态下的假阳性反应过高,影响实验结果,对此我们将每次训练的间隔期延长为3分钟,有效控制了假阳性率的出现。

 

我们认为利用跳台反射法建立的耳鸣动物行为模型具有成功率高、稳定且可操作性好的优点,可以应用于对耳鸣发生机制方面的研究。

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