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强迫游泳和Morris水迷宫实验对小胶质细胞在认知障碍髄鞘修复中的研究
点击次数:243 发布时间:2020-05-11

摘要

   血管性认知功能障碍(Vascular Cognitive ImpairmentVCI)是全球di二大常见 的认知功能障碍,约占所有痴呆的20%,其中,脑白质损伤,即髓鞘或少突胶质细胞 (OligodendrocytesOLs)损伤是VCI重要的病理改变。近年来中枢神经系统炎症细 胞小胶质细胞激活与白质损伤的关系备受关注。我们前期在VCI动物模型中发 现,VCI小鼠髓鞘受损、小胶质细胞大量激活。同时,缺血引起小胶质细胞 Fractalkine/CX3CR1通路激活、CX3CR1表达上调,其下游核转录因子kB-P50/65 (Nuclear Factor- Kappa B, NF-kB)表达升高使小胶质细胞释放更多促炎因子,并导 致认知功能障碍。因此我们提出通过调控CX3CR1相关信号通路调控小胶质细胞激 活、减轻炎症反应,从而保护OLs促进少突胶质细胞前体细胞(Oligodendrocyte Prescusor Cells, OPCs)成熟分化修复髓鞘并改善VCI认知功能。

   本课题米用双侧颈总动脉结扎(Bilateral Common Carotid Artery OcclusionBCCAO)术构建VCI模型,分别对CX3CR1及其通路下游关键因子NF-kB与非受 体型酪氨酸蛋白激酶Src进行拮抗。通过悬尾不动实验(Tail Suspension TestTST) 与强迫游泳实验(Forced Swimming TestFST)观察药物抗抑郁作用;Morris水迷宫 (Morris Water MazeMWM)观察动物海马相关学习记忆功能改善情况。采用酶联 免疫吸附法Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测外周血清中炎症因子 与髓鞘相关蛋白含量,坚牢蓝(Luxol Fast BlueLFB)染色以及免疫组织化学染色 标记髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic ProteinMBP)分别观察胼胝体(Corpus Callosum, CC) 与海马区髓鞘损伤与修复情况,免疫组织化学法标记离子钙接头蛋白抗原(Ionized Calcium Binding Adapter Molecule 1Iba-1)神经胶质细胞抗原Neuron-glial Antigen 2NG2)04与神经元核抗原(Neuronal Nuclei, Neun)观察海马激活小胶质细胞、 OPCs成熟前OLs与神经元数量。采用蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB)法对海 马区MBP含量进行检测。

   第yi部分研究表明,CX3CR1中和抗体anti-FKR干预后,VCI小鼠TSTFST不动时间明显缩短;MWM隐蔽站台实验第4天找到站台潜伏期时间明显缩短,空间 探索实验穿越目标象限的次数、在目标象限停留的时间以及在目标象限游动的路程占 总游动路程百分比均较VCI+NS组明显增加,提示拮抗CX3CR1明显改善VCI小鼠 抑郁行为与海马相关学习记忆功能。CCLFB与免疫组织化学MBP染色相应IOD 值差异不具有统计学意义,而海马区免疫组化MBP染色以及WB分析MBP相应IOD 值明显升高,外周血清MOG含量下降,提示拮抗CX3CR1能保护海马区髓鞘并促进 髓鞘修复。拮抗CX3CR1后,海马区Iba-1阳性细胞数目明显减少,同时ELISA结 果显示VCI+anti-FKRIL-ipTNF-a含量较VCI+NS组明显降低,表明拮抗CX3CR1能抑制小胶质细胞激活并减轻VCI小鼠炎症反应。此外,anti-FKR稍减少 海马区NG2阳性细胞数并明显增加04Nerni阳性细胞数,提示拮抗CX3CR1能促 进海马区OPCs成熟分化、修复受损髓鞘,并保护神经元。

    第二部分研究表明,NF-kB拮抗剂PDTC干预后,VCI小鼠TSTFST不动时 间明显缩短,而Src拮抗剂PP2上述作用并不明显。VCI+PDTC小鼠MWM隐蔽站 台实验第4天找到站台潜伏期、空间探索实验游动速度、穿越平台次数、在平台象限 停留时间、路程差异均不具有统计学意义,而VCI+PP2小鼠在隐蔽站台实验找到站 台潜伏期时间明显缩短,空间探索实验穿越目标象限的次数与在目标象限游动的路 程占总游动路程百分比均较VCI+NS组明显增加。拮抗NF-kBSrc蛋白后,CCLFBMBP染色相应:[OD值比较结果显示差异均不具有统计学意义。使用PP2能 明显增加海马区MBP免疫组织化学染色IOD值,并减少外周血中MOG含量,提示 拮抗Src能保护海马区髓鞘并促进修复。与VCI+NS组相比,PDTC+NS组小鼠海马 区Iba-1阳性细胞数明显减少,血清ELISAIL-6TNF-aHMGB1含量明显降低, 提示拮抗NF-kB能抑制内源性小胶质细胞激活并减轻炎症反应。与VCI+NS组相比, PP2+NS组小鼠海马区04阳性细胞数明显增加、NG2阳性细胞数稍有减少而Iba-1 Neun阳性细胞数没有明显差异。提示拮抗Src能促进海马区OPCs成熟分化修复 髓鞘。

上述实验结果表明,CX3CR1中和抗体anti-FKR通过抑制CX3CR1通路能有效

   抑制VCI小鼠小胶质细胞激活并控制炎症反应、保护海马区神经元、促进海马区OPCs 成熟分化并修复髓鞘,从而改善缺血小鼠认知功能障碍。NF-kB抑制剂PDTC能减 少VCI动物在缺血缺氧时引起的小胶质细胞激活、缓解炎症,而Src抑制剂PP2能 减少VCI小鼠缺血缺氧时髓鞘的损伤并促进OPCs成熟分化、髓鞘修复,从而分别改 善VCI小鼠的抑郁与认知功能障碍。因此,调控CX3CR1下游的Src和域NF-kB的 作用可能是未来预防与治疗VCI潜在的重要靶点。

关键词血管性认知功能障碍,髓鞘,少突胶质细胞,小胶质细胞, Fractalkine/CX3CR1 通路

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