阻燃剂TCPP暴露对小鼠的神经毒理作用观察及相关机制研究

【摘要】目的探讨阻燃剂TCPP (tris(2~chloroisopropyl) phosphate)暴露对小鼠的神经毒理作用观察及相关 机制研究。方法将30只成年KM小鼠随机分为正常对照组（0 mgKkg，d))、低剂量（TCPP)组（10 mgKkg，d))

和高剂量TCPP组（100 mg^kg*d)),持续灌胃染毒30 d。染毒结束后，观察其体质量及一般情况。采用水迷宫实 验检测小鼠的学习记忆能力；采用化学发光免疫分析法测定小鼠血清总三碘甲腺原氨酸（TT3)、游离三碘甲腺原氨 酸（FT3)、总四碘甲腺原氨酸（TT4)和游离四碘甲腺原氨酸（FT4)水平；采用比色法测定小鼠脑组织中谷胱甘肽转 移酶（GST)和超氣化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、过氣化氢酶（CAT)水平。结果与对照组小鼠相比,TCPP 高剂量组小鼠饮水量显著下降（P< 0. 05),肝和脾脏器指数明显升高（P< 0. 05)。TCPP暴露组小鼠在水迷宫实验 中逃避潜伏期均较正常组小鼠出现延长（P< 0. 05),高剂量组小鼠游泳总路程出现明显升高（P< 0. 05),同时在目 标象限停留时间也明显缩短（P< 0. 05)。高剂量TCPP染毒组小鼠与对照组小鼠相比TT3、FT3出现明显增高（P<

0. 05)。与对照组小鼠相比，高剂量TCPP染毒组小鼠GST、OD出现明显降低，MDA显著增高（P< 0. 05)。与对照 组小鼠相比,低剂量TCPP染毒组小鼠仅GST出现降低,MDA增高（P< 0.05)。结论TCPP暴露具有明显的神经 毒性作用，能造成小鼠学习记忆能力丧失，其毒性机制可能与脑组织氣化损伤及甲状腺激素增高有关。

【关键词】TCPP;学习记忆；甲状腺激素;氣化损伤;小鼠

有机磷阻燃剂（organophosphate flame retardants, OPFRs)是一种化学性质稳定，并能在环 境中长期存在的新型阻燃剂。空气、水体中的 OPFRs会通过呼吸道、消化道进入生物体内¹⁰。随 着多漠联苯酿（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)类阻燃剂的禁用，OPFRs的使用量与日俱 增。有研究显示，多种环境介质及生物体内OPFRs 检出浓度逐年递增⁰。OPFRs具有多种同系物，其 中磷酸三（2-氯丙基）醋（tris (2~chloroisopropyl) phosphate, TCPP)是目前zui常见的有机磷阻燃剂，而 且在我国环境中广泛存在^H。近年来，大量研究证 实OPFRs具有神经毒性、生殖毒性、内分泌干扰效 应、发育毒性、致癌性^a ,其中以神经毒性及甲状腺 干扰效应zui为显著^[4-5。TCPP作为可疑的甲状腺 激素干扰物（TDCs),可能会对甲状腺激素产生干扰 效应⁰。甲状腺激素功能的紊乱，会影响神经及大 脑的发育。因此，本研究以TCPP为受试物，通过对 KM小鼠灌胃染毒，探索TCPP暴露对KM小鼠学习 记忆能力及其血清甲状腺激素水平的影响。

1材料和方法

1.1实验动物

清洁级4周龄KM小鼠，由桂林医学院实验动 物中心提供SCXK (桂）2013-0001], 60只，雌雄 各半，体质量（26.6 ±4) g。小鼠饲养于桂林医学 院公共卫生学院SPF级动物房SYXK (桂）2013- 0001],自由采食和饮水，室内温度20癈 ~ 25°C,湿 度40% ~ 70%, 12 h亮暗循环。本研究获得桂林医 学院实验动物伦理委员会审查批准（GLMC: 201710020)。小鼠的饲养及使用过程严格遵守《美 国公共卫生署人道管理和使用实验动物政策》^[7。

KM小鼠在实验中处于舒适的环境，并为其提供足 够的水和食物，舒适的睡眠，按实验动物使用的3R 原则对其给予人道的关怀。

1.2主要仪器

Morris水迷宫检测系统，产品型号XR- XM101 (上海欣软信息科技公司）。

3讨论

OPFRs是由磷酸根骨架及三个取代基组成，根 据取代基的种类，可以分为烷基OPFRs、芳基 OPFRs、卤代（主要是氯）烷基OPFRs三种。卤代烷 基OPFRs中又分为TCPP (磷酸三（2-氯丙基）酯）、 冗瓦？（磷酸三氯乙酯）、丁0匸？？（磷酸三（2,3-二氯 丙基）酯）、TDCIPP (磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯）。 TCPP 的化学结构与 TCEP、TDCPP、TDCPP、TDCIPP 相似，均是氯化OPFRs,可以在环境中长期存在。 TCPP是目前数量多运用zui广的氯化OPFRs,可 能对环境生物和人体带来巨大危害。目前，大量研 究集中在TCPP对环境生物的影响。有研究表明, TCPP通过干扰内分泌系统来影响斑马鱼的发 育^¹。TCPP暴露会导致秀丽线虫生殖发育障碍、 运动行为损伤和神经毒性等^M。通过大鼠垂体瘤 细胞（GH3)增殖实验，发现TCPP对甲状腺激素具 有干扰效应⁶³。

然而TCPP对晡乳动物的毒性研究很少。本研 究发现,高剂量TCPP (100 mgKkg*d))灌胃后小鼠 饮水量出现降低，肝和脾脏器指数出现显著升高。 这一现象，与其同系物TDCIPP的实验结果十分相 似。Zhao 等⁶¹² 用 TDCIPP (100 mgKkg.d)、250 mg^kg*d))灌胃青春期雌性大鼠21 d,也出现肝脏 器指数、（肝、肾脏器指数）的增加。

TDCIPP(150 mgKkg-d))灌胃大鼠也出现了母鼠 肝质量的增加。这些结果说明，高剂量的TCPP暴 露会对小鼠的生长和发育带来不利的影响。但是 皮天星等^M用TCPP对成熟斑马鱼进行染毒，发现 肝指数随着浓度的增加而降低。

TCPP等多种OPFRs(22 ng/g)染毒鸟类21 d,并未 观察鸟类肝出现氧化损伤，但是肝细胞的完整性和功能性发生适度的改变。以上结果的不同，可能是 因为实验动物的种类和剂量、染毒方式的不同所致。

本研究发现，高剂量TCPP染毒组小鼠逃避潜 伏期和游行总路程出现明显延长，在第三象限停留 时间出现下降，说明TCPP暴露后小鼠的学习、记忆 能力出现明显下降。这一结果说明，TCPP和其他 氯化OPFRs -样，具有明显的神经毒性。Tilson 等M用Tcep急性短期（275 mg/kg)灌胃雌性大 鼠，在水迷宫实验中也出现了学习记忆能力受损。 这些结果与海马椎体细胞大量减少有着密切的关 联。Umezu等^M用TCEP急性短期（200 mg/kg)灌 胃小鼠，小鼠自发性走动活动增加。这个结果可能 是TCEP拮抗神经递质₇省基丁酸（GABA)有关。 由于有机磷酸酯类阻燃剂在结构上有与有机磷农 药类似的磷酸二酯键,也有研究认为OPFRs可能通 过抑制胆碱酯酶产生神经毒性⁶¹⁶。但是对线虫进 行TCEP或TCPP染毒会导致线虫自主运动缺陷、 帕金森样运动障碍，引起多巴胺能神经元退化。 TDCIPP对大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12)染毒时,导 致细胞内钙超载，从而激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号通路¹³。上述研究虽然提出了研究 OPFRs的神经毒性机制的新方向，但多为体外或脊 椎动物,还需要进一步在体内和其他物种特别是晡 乳动物中进一步探讨。

甲状腺激素在人类和动物的生理过程中起到 了重要作用，尤其是在中枢神经系统的分化、发育 及各种功能形成过程中。因此，干扰甲状腺激素将 会对正常生理功能产生严重不良反应。由于TCPP 的化学结构与TT3和TT4结构相似，因此TCPP可 能对甲状腺素产生干扰效应,故被列为可疑甲状腺 激素干扰物（TDCs)。流行病学研究显示，室内粉尘 中TDCIPP的含量与人体血清中FT4有着密切的关 系，二者出现负相关^M。本次研究发现，高剂量 TCPP染毒组小鼠与对照组小鼠相比TT3、FT3出现 明显增高。同为氯代有机磷阻燃剂的TDCIPP对大 鼠染毒，也出现了 TT3增高的结论^M。但是 TDCIPP对鸡胚、斑马鱼染毒，均出现了 TT4减少的 现象^⁹ — ²⁰,而本研究TT4未出现明显改变。以上 结论出现不同的原因，可能是因为，相对于其他物 种，晡乳动物具有更好的免疫力和强大的自我调节 机制。当外界环境出现改变时，机体内甲状腺激素 (thyroid hormones, TH)水平会受到干扰。晡乳动物 往往比卵生动物更快的启动调节机制，如脑垂体和 下丘脑的负反馈调节及甲状腺代偿机制来维持甲 状腺激素的稳态。而且，卵生动物与晡乳动物有着 不同的吸收、分布、代谢、排出的过程。卵生动物免 疫功能及外界环境抗干扰能力显著低于晡乳动物, 所以卵生动物比晡乳动物更加敏感。本研究发现
高剂量染毒导致甲状腺激素增高，可能是机体的补 偿机制。同为阻燃剂的多溴联苯醚，也出现了类似 的效应。而且，多个时间点甲状腺激素的变化水 平，往往比单个时间点甲状腺激素水平更有意义。 但是，由于本研究经费有限，因此没有进行多点 检测。

大脑是机体代谢旺盛的器官，其抗氧化能力 比较弱。本研究发现，高剂量tcpp暴露均可导致 小鼠脑组织中MDA水平升高（P< 0. 05), GST和 SOD活力下降（P< 0. 05),以及小鼠的学习、记忆能 力出现明显下降。说明氧化应激在TCPP的神经毒 性中起到重要作用。有研究报道，较高浓度TCPP (100、150、200 pm〇l/L)对人肝癌细胞（HepG2)、人 肺腺癌细胞（A549)、人结肠腺癌细胞（Caco-2)细胞 染毒时，相关细胞活力将受到抑制，其原因是细胞 内产生大量活性氧、诱导DNA损伤及乳酸脱氢酶 (LDH)大量渗出⁰²¹。此外其同系物TDCIPP(30、 60 pm〇l/L)对PC12细胞染毒时，细胞内活性氧增 多,SOD与GSH随之剂量增高而降低，而MDA呈现 增高的趋势¹²²。以上研究与本研究结果比较一致。

本研究发现，高剂量TCPP染毒导致小鼠产生 神经毒性及血清中TT3、FT3出现明显增高。甲状 腺激素水平的增高，可以介导产生大量活性氧，导 致脑细胞脂质过氧化和脑细胞损伤的发生，终导 致学习记忆能力下降^M。综上，TCPP暴露具有明 显的神经毒性,其毒性机制可能与脑组织氧化损伤 及甲状腺激素紊乱有关。