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目的探讨1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)亚急性暴露对大鼠抑郁样行为的影响及其可能单胺神经递质的作用 机制。方法无特定病原体级雄性SD大鼠随机分为对照组和低、中、高剂量组,每组10只,分别予0、20、40、
80 mg/kg体质量的1,2-DCE(以玉米油稀释)灌胃染毒,每2天1次,连续染毒14次。染毒结束后,采用旷场实验、
糖水偏爱实验和强迫游泳实验观察大鼠行为学变化情况,采用液相色谱-电化学检测法测定大鼠大脑前额皮 层、海马、纹状体中单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)和多巴胺水平。结果与对照组比较,
中、高剂量组大鼠直立次数、中心区域活动时间和路程均减少(P <0.05),糖水偏爱度下降(P <0. 05),强迫游泳实 验中不动时间延长(P<0. 05)。大鼠前额皮层、海马、纹状体内5-HT、NA和多巴胺水平均随着1,2-DCE染毒剂量 的增加而下降(P <0.05),呈剂量-效应关系。高剂量组大鼠前额皮层、海马、纹状体内5-HT、NA和多巴胺水平均 低于对照组(P<0. 05)。结论1,2-DCE亚急性暴露可诱导大鼠抑郁样行为,其机制可能与降低前额皮层、海马、
纹状体内单胺类神经递质的水平相关。
关键词:1,2-二氯乙烷;抑郁症;单胺类神经递质;5-羟色胺;去甲肾上腺素;多巴胺;行为学;大鼠
1材料和方法
1.1动物无特定病原体级雄性SD大鼠广东省实 验动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(粵)2013- 00002] 40只,体质量180 ~220 g。大鼠饲养于广东省 职业病防治院实验动物屏障设施(无特定病原体级动 物房)内实验动物使用许可证号:SYXK (粵)2014- 0048],自由进食和饮水。本研究经广东省职业病防 治院实验动物伦理委员会批准。
1.2仪器和试剂旷场实验装置、SuperMaze旷场试 验视频分析系统(XR-XZ301,上海欣软信息科技有限公司);强迫 游泳实验装置(为带有高度标记的透明圆柱形游泳 桶,上海欣软信息科技有限公司);0. 22 pm滤膜(上 海安谱实验科技有限公司);Agilent RX~C18色谱柱 (250. 0 mm X 3.0 mm X5. 0 pm)、Agilent 1260 液 相色谱系统(美国Agilent公司);CoulochemM电化学 检测器(美国ESA公司);Millipore超纯水机(美国 Millipore 公司)。1,2~DCE (分析纯,纯度彡99. 50%, 广州化学试剂厂);玉米油(益海嘉里食品营销有限公 司);异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);高氯 酸(优级纯),NA、-辛烷磺酸钠、磷酸氢二钠、乙二胺 四乙酸二钠、三乙胺(均为色谱纯度),5~HT、多巴胺(均 为分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈 (色谱纯,美国赛默飞世尔科技公司)。蛋白沉淀液为 含浓度为0.100 mmol/L的高氯酸和体积分数为 0. 01%乙二胺四乙酸二钠的水溶液。磷酸二氢钠缓冲 溶液为含浓度分别为1. 700、25. 000、0. 025、0. 700 mmol/L的1-辛烷磺酸钠、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸 二钠和三乙胺的水溶液,pH值为3. 0)。
1.3动物分组与染毒大鼠经检疫并适应性饲养 1周后,采用随机数表法分为对照组和低、中、高剂量 组,每组10只。本研究预实验结果显示,雄性SD大 鼠半数致死量为681 mg/kg体质量。参照本课题组前 期研究8 ,本研究设计1,2~DCE染毒剂量在低、中、高 剂量组分别为20、40和80 mg/kg体质量。实验时,低、 中、高剂量组大鼠分别予质量浓度为20、40、80 g/L的 1,2~DCE溶液(以玉米油配制)灌胃,灌胃体积为 1 mL/kg体质量,对照组大鼠给予等体积玉米油灌胃; 隔曰灌胃1次,共染毒14次。实验期间观察大鼠活 动、饮水饮食等情况。染毒结束时,3组大鼠共摄入相 当于0. 411、0.822、1.645倍半数致死量的1,2-DCE。 于末次染毒24 h后进行行为学测试。
1.4行为学测试
1.4.1旷场实验实验在4个涂黑敞箱内进行,敞箱 底面等分成25个正方形。实验在相对安静的环境下 开始。将大鼠轻轻放入箱体中央,采集5 min内大鼠 在箱内的活动情况。中央和外周区域活动时间及路 程由Flyde-maze旷场试验视频分析系统记录,直立次 数由未知实验方案的研究人员记录。
1.4.2糖水偏爱实验实验前进行大鼠糖水适应性 训练:首先每笼放置2瓶糖水(质量分数为1.00%), 1 d后改为1瓶糖水和1瓶纯水,连续放置24 h。大鼠 经适应性训练后,禁食禁水1 d,开始糖水偏爱实验。 实验开始前称量1瓶糖水和1瓶纯水的质量后将其放 入笼内由大鼠随意饮用;24 h后,分别称量糖水和纯水的剩余质量,计算消耗量,以分析大鼠的糖水偏爱度。 糖水偏爱度=糖水消耗量/总液体消耗量X100. 00%。 1.4.3强迫游泳实验适应性训练:实验前1 d,将 约23 °C的水注入强迫游泳实验装置内,高度>30 cm; 将大鼠放入装置,使其漂浮于水上,并使其下肢无法 触及装置底部以支撑其身体;当大鼠适应水温和水环 境后,使其自由游泳6 min。24 h后,在相同的实验条 件下,进行正式实验,观察时间为6 min,观察期内大 鼠在桶内自由游泳。由未知实验方案的研究人员记 录大鼠2 ~6 min内的不动时间。以大鼠停止任何挣 扎,漂浮于水面不动或仅做一些支持漂浮在水面的轻 微肢体活动定义为不动状态。
1.5脑组织样品采集及处理于行为学测试结束 后,将大鼠放入麻醉装置中给予异氟烷吸入,麻醉后 经腹主动脉采血,放血法处死。迅速取出全脑,于冰 上分离前额皮层、海马和纹状体等,置于冻存管,以液 氮迅速冷却后,于-80 °C冰箱保存。检测时,从冰箱 中取出冻存的组织样品,称质量后置于匀浆器中,按 1 g :5 mL比例加入预先冷冻4 C的蛋白沉淀液体,冰 浴下快速匀浆2 min。匀浆液于4 C、4 000 xg离心 30 min,取上清液用0.22 pm滤膜过滤后,待测。
1.6脑组织中单胺类神经递质水平检测参照文献 9],采用液相色谱-电化学检测法测定1.5制 备的大鼠海马、前额皮层和纹状体样品中5~HT、NA和 多巴胺水平。色谱条件:流速1.0 mL/min;进样体积 20 pL;流动相组成A相(磷酸二氢钠缓冲溶液):B相 (乙腈)=90 : 10 (V/V);柱温35 C ;检测电势: Et = -150 V,E2 =220 V。该方法的 5-HT、NA 和多巴 胺水平检出限分别为1. 1、1. 0、1. 1 pg/L,加标回收 率分别为 88. 60% ~ 94. 60%、93. 50% ~ 95. 10%、 89. 90% ~95.50%。
1. 7统计学分析采用SPSS 23. 0软件进行统计分 析。计量资料经正态性检验符合正态分布,以x ± s描 述;多组组间均数比较采用单因素方差分析,组间均 数两两比较方差齐时采用SNK检验,方差不齐时采用 Dennett T3法。采用一兀线性回归分析1,2—)CE染 毒剂量与单胺神经递质水平的剂量-效应关系;检验
水准a =0.05 (双侧)。
2结果
2.1基本情况对照组和低剂量组大鼠毛发光泽、 精神状态、活动、饮水和摄食均正常;中剂量组和高剂 量大鼠分别于染毒第9天和第5天后可观察到活动和 精神状态异常持续至染毒结束,表现为精神萎靡、俯 卧、活动减少、弓背。染毒周期内各组大鼠均无死亡。 2.2行为学实验结果与对照组比较,中、高剂量组 大鼠直立次数、中心区域活动时间及路程均减少,糖 水偏爱度下降,游泳中的不动时间延长,差异均有统 计学意义(P <0.05)。见表1。
2.3 1,2—)CE暴露对大鼠不同脑区中单胺类神经递
质水平的影响4组大鼠前额皮层、海马和纹状体中 5~HT、NA和多巴胺水平分别比较,差异均有统计学意 义(P <0.01)。两两比较结果见表2。可见,高剂量 组大鼠3种脑区组织中5~HT、NA和多巴胺水平均低 于对照组,差异均有统计学意义(P <0.05)。分别以 前额皮层、海马和纹状体的3种单胺神经递质水平 (y)和1,2~DCE染毒剂量(x)进行一元线性回归分析, 结果显示回归方程均成立(P< 0.01)。随着
表1 4组大鼠行为学指标比较结果 (x±s)
组别 | 动物数 | 直立次数 | 中心区域活动 | 中心区域活动 | 总路程 | 糖水偏爱度 | 不动时间 |
(只) | (次) | 时间(s) | 路程(mm) | (mm) | (%) | C s) | |
对照组 | 10 | 25.5±5.7 | 21.8±6.5 | 175.5±24.0 | 1 838.9 ±299.4 | 71. 00 ± 8. 60 | 50.1 ?1.8 |
低剂量组 | 10 | 24.6±4.0 | 20.0 ±4.5 | 180.3 ?7.5 | 1 897.2 ?68.3 | 68.50 ?.80 | 55.8 ?0.4 |
中剂量组 | 10 | 19.5?.1ab | 15.0?.8ab | 147.7?4.2ab | 1 703.7 ?09.8 | 59.50?0.50a | 64.0?.8a |
高剂量组 | 10 | 17.4?.0ab | 13.9?.7ab | 140.7?6.4ab | 1 616.2 ?46.4 | 59.30?1.30a | 61.6?.9a |
F值 |
| 6.81 | 7.16 | 4.95 | 2. 04 | 4. 26 | 4. 36 |
P值 |
| <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0. 12 | 0. 01 | 0. 01 |
注:与对照组比较,P <0.05;与低剂量组比较,bP <0. 05
表2 4组大鼠前额皮层、海马、纹状体中5~HT、NA和多巴胺水平比较(X御,ng/g)
组别 | 动物数 |
| 5-HT |
|
| NA |
|
| 多巴胺 |
|
(只) | 前额皮层 | 海马 | 纹状体 | 前额皮层 | 海马 | 纹状体 | 前额皮层 | 海马 | 纹状体 | |
对照组 | 10 | 281.3±29.0 | 176.1 ?3.1 | 499.8?2.6 | 190.6±52.6 | 328.6 ?2.0 | 166.9?3.9 | 270.1 ?3.6 | 138.3?7.7 | 4738.2?25.5 |
低剂量组 | 10 | 266.2 ±32.8 | 159.1 ?6.9 | 471.2?3.4 | 179.3 ?2.2 | 323.0?1.4 | 161.9?6.5 | 256.3 ?0.8 | 121.9?9.2 | 4516.2?11.0 |
中剂量组 | 10 | 251.0±47.6 | 138.5?8.4a | 335.9?5.6ab | 122.6?4.8ab | 253.0 ?7.4ab | 109.7?0.5ab | 249.6?2.1 | 112.1?1.5a | 3 957.4?95.4a |
高剂量组 | 10 | 194.1?1.9abc | 102.4?6.5abc | 328.4?9.4ab | 119.8?3.7ab | 239.8 ?3.0ab | 97.4?7.9ab | 172.2?1.2abc | 74.9?0.0abc | 3 182.4?505.7abc |
F值 |
| 9.78 | 14.57 | 19.98 | 6.37 | 4. 86 | 5. 48 | 10.16 | 18.71 | 10.86 |
P值 |
| <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0. 01 | <0. 01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注:与对照组比较,aP<0.05;与低剂量组比较,bP<0.05;与中剂量组比较,cP<0.05
表3 1,24)CE染毒与前额皮层、海马、纹状体5~HT、NA和多巴胺水平的剂量-效应关系分析结果
单胺神经递质 |
| 回归方程 | 决定系数 | F值 | a值 | t值 | P2值 | |
5-HT | ||||||||
前额皮层 | y = | -1.10 x | :+286.67 | 0. 44 | 29.44 | <0.01 | 30. 87 | <0.01 |
海马 | y = | -0.93 x | :+ 176.55 | 0. 55 | 46.06 | <0.01 | 28.14 | <0.01 |
纹状体 | y = | -2.32 x | :+489.88 | 0. 49 | 36. 42 | <0.01 | 27.86 | <0.01 |
NA | ||||||||
前额皮层 | y = | -0.96 x | +186.65 | 0. 27 | 14. 08 | <0.01 | 15.94 | <0.01 |
海马 | y = | -1.23 x | + 329. 02 | 0. 24 | 11.79 | <0.01 | 20.10 | <0.01 |
纹状体 | y = | -0.95 x | + 167. 38 | 0. 26 | 13. 58 | <0.01 | 14.11 | <0.01 |
多巴胺 | ||||||||
前额皮层 | y = | -1.23 x | + 280. 08 | 0. 42 | 27.08 | <0.01 | 25.88 | <0.01 |
海马 | y = | -0.78 x | +139.18 | 0. 60 | 57. 60 | <0.01 | 29.47 | <0.01 |
纹状体 | y = | -20.17 | x +4 804.44 | 0. 47 | 33.53 | <0.01 | 30. 10 | <0.01 |
注:FPi值和t、P2值分别为回归方程检验和回归系数检验的结果
3讨论
机体受到环境中病毒、细菌和有毒有害化学物质 等因素影响后,在出现病理改变和临床症状前通常会 出现行为功能障碍或其他指标异常;特定行为学的改 变能够准确反映中枢神经系统的生理或病理状态,可 作为神经毒性的前期指标M。1,24)CE急性或亚急 性中毒主要临床表现为中毒性脑病,脑水肿为主要病 理基础tt1-12。1,24)CE中毒患者可出现头晕、情感淡 漠、谵妄、抽搐、记忆力下降、反应迟钝、计算力下降等 临床症状M ;患者病情迁延,易反复或突然恶化,后遗 症发生率及死亡率高对生命和健康影响极大。因 此,研究1,24)CE对神经行为的影响对阐明其神经毒 性具有重要意义。
本课题组前期的Morris水迷宫实验结果显示,以 剂量为100和350 mg/m3的1,24)CE静式吸入连续染 毒28 d,可引起小鼠空间学习和记忆能力下降,且随 着染毒剂量增加和时间延长,其毒性效应增强M。杨 光谦等15的研究以剂量为1 200 mg/m3的1,2-)CE 静式吸入染毒3 d,结果导致小鼠出现脑损伤,行为学 表现为抱爪现象。旷场实验主要用于评价实验动物 在新异环境(即开阔环境)中的自主行为、探究行为与 紧张度16。糖水偏爱实验可反映大鼠欣快感E7]。强 迫游泳实验也被称为绝望实验,是经典的抑郁类行为 学实验,主要测量动物的活跃性;其中的漂浮行为被 用作分析“绝望”的参数,因此也被认为是类似抑郁的 行为M。本课题组前期以剂量为79 mg/kg体质量的
职业性有机溶剂接触可对职业工人的心理健康 状况产生不同程度的损害。有研究结果显示,苯系物 职业接触可引起女性工人在人际关系敏感、抑郁、焦 虑、敌对4个因子评分上明显上升E9];正已烷接触工 人消极情绪(紧张-焦虑、抑郁-沮丧、愤怒-敌意、 疲惫-惰性、困惑-迷茫)得分升高,而心算平均准确 数、心算能力平均指数、听数字广度平均准确数、听数 字广度能力指数、曲线吻合平均准确数、曲线吻合平 均能力指数、目标追踪平均准确数均下降M ; 1,24)CE中毒性脑病患者的焦虑和抑郁评分值明显升 高M ;但机制尚不清楚。抑郁症病因复杂,且受多种 环境、生理和心理性因素影响°22。目前抑郁症病因机 制主要研究包括:炎症假说、氧化应激假说、神经营养 假说和神经递质假说等^-25 ;其中以单胺神经递质 假说为久远成熟,该机制认为脑内单胺类神经递质 如5~HT、NA、多巴胺等的缺乏或代谢异常是导致抑郁 症的主要因素^6-28。抑郁症患者脑的结构和功能 改变主要存在于前额皮层、海马和纹状体等29];而精 神活动的异常与中枢神经系统突触内的单胺类递质 5~HT、NA和多巴胺代谢水平失衡密切相关°9。本研 究发现,随着1,2~DCE染毒剂量增加,大鼠纹状体、海 马和前额皮层中5~HT、NA和多巴胺均呈下降趋势 (P<0.05);其中,高剂量组大鼠3个脑区中5~HT、NA 和多巴胺水平均低于对照组(P < 0. 05);提示
综上所述,1,2—)CE亚急性暴露可诱导大鼠出现 抑郁样行为,其机制可能与降低前额皮层、海马和纹 状体内单胺类神经递质的水平变化有关。但该机制 研究只是对神经递质改变的初步探讨,具体哪些相关 信号通路(蛋白和RNA)参与了该过程尚需进一步深 入研究。