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巴恩斯迷宫实验对缺血性脑卒中大鼠行为学的影响
点击次数:333 发布时间:2019-07-19

脑血管疾病是威胁人类健康的重大疾病之一,包 括缺血性和出血性两类[1]。缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular diseaseICVD)在老年人中具有高发 病率、患病率、致残率和死亡率,且发病逐渐年轻化。 加大脑血管病防治力度,改善预后,预防并发症,提高 脑血管疾病的疗效是一项刻不容缓的重任。目前,虽 然对ICVD的治疗取得了较大的进步,在溶栓和(或) 取栓同时,也可使用神经保护剂来避免或减少再灌 注损伤,但仍无一种神经保护的药物可使患者从中 获益[2],研究表明电针在ICVD中的应用中能促进其 功能恢复[3],己是缺血性脑血管病的常规治法。本实 验主要通过电针来干预脑缺血大鼠模型,为针刺治疗 ICVD提供实验研究依据。

1材料

1.1实验动物选择18月龄,雄性,体质量200〜

250 gSD大鼠80只,均购买并饲养于安徽中医 药大学实验动物中心,预适应1周后方开始实验。 大鼠选用清洁级颗粒饲料喂养,并予自由饮食及饮 水,视垫料清洁的程度更换垫料。饲料和垫料均购文草编号:1000-2723(2018) 04-0025-04 买于安徽中医药大学实验动物中心,饲养环境模拟 标准日夜系统。

1.2实验仪器G6805型电针治疗仪:苏州医疗用 品厂有限公司;电凝器;牙科钻;华佗牌一次性针灸 针苏州规格为直径0.2 mm针身长0.5Barnes 迷宫测试板、圆形滚筒:上海欣软XR-XB108型巴恩 斯迷宫视频分析系统。

2实验方法

2.1实验分组80只SD大鼠随机分为假手术组

(该组只行血管分离)、模型组、电针对照组、电针组, 每组20只。

2.2大脑中动脉闭塞大鼠模型的建立及成功与否检

测的方法在室温25 °C条件下,SD大鼠称重后,根 据罗燕等[4]提出的热凝闭大脑中动脉法制造局灶性 脑缺血大鼠模型:将SD大鼠右侧卧位固定于手术台 上,去除左侧颞顶部的鼠毛,碘伏对颞顶部局部皮肤 消毒。左眼与左耳之间切开皮肤,钝性分离颞肌,暴露 出颞骨翼板,术中避免损伤周围血管及神经等。用牙 科钻经颞骨翼板钻至硬脑膜,用小咬骨钳向下咬去部分颅骨,暴露大脑中动脉,用电凝器来凝闭大脑中动 脉(嗅束到大脑下静脉),后缝合颞肌及皮肤。

假手术组:同上操作到暴露大脑中动脉,不进行 热凝闭。

大鼠苏醒后参照Zea Longa E[5]提出的神经行 为学评估法进行评分,评分1~3分表示造模成功,采 用差额补充的方法保证每组实验的例数。

2.3处理方法电针组:造模成功后将不予麻醉的 大鼠固定在自制鼠夹上。根据华兴邦等[6]制定的大 鼠针灸穴位进行定位,选用“醒脑开窍”针刺法[7],主 穴取水沟、百会和双侧内关、三阴交。先用捻转、提插 泻法刺激双侧内关1 mm至筋间,刺激1 min留针 30 min;次用雀啄法由鼻中隔下部向上斜刺水沟1 mm强刺激1 min;再应用提插法直刺三阴交5 mm持续1 min;后刺百会穴,取向前或向后斜刺2 mm采用平补平泻捻转手法刺激1 min留针30 min留针期间,分别用G6805电针治疗仪连接内关 和三阴交穴位的针柄,施以疏密波,调整电压为2~4 V频率为2/100 Hz以针刺部位轻微抖动为刺激强 度。第1次针刺在造模成功后的24 h内进行,以后每 天上午固定时间针刺1次每7 d为1个疗程(连续 针刺6 d休息1 d)[8-9]

电针对照组:SD大鼠不进行任何手术,抓取、固 定方法针刺穴位方法频率电针刺激参数等同电 针治疗组。

假手术组、模型组:抓取、固定方法参数等同电针 组,但不进行针刺。

2.4观察指标

2.4.1大鼠神经行为学评分[5] 0分:无神经缺损症

状;1分:将大鼠提尾倒悬时,左侧前爪不能完全伸 展;2分:爬行时左侧转圈;3分:行走困难、向左侧倾 倒;4分:不能自发行走,意识丧失。

2.4.2 Barnes记忆分析系统检测训练过程:将大鼠 逐只放在圆形漆黑Barnes迷宫测试板上,测试板的 周围有20个洞口,底部放置底盒的一个洞口称之为 隐藏区,其余称之为暴露区,每次训练开始时将大鼠 放置于隐藏区让其适应30 s然后将其放在迷宫中 央自由选择进入隐藏区每次训练240 s每只老鼠 做完以后都用酒精对迷宫进行擦拭。每天下午每只大 鼠连续训练2次连续训练6 d

测试过程:第1 d训练结束后按分组测试,然后 连续训练6 d后第7 d开始测试,按分组开始测试, 测试过程同训练过程,每只测试2次Barnes迷宫

映了动物的空间记忆功能。

2.4.3滚筒掉落时间检测选用直径20 cm圆形滚 筒设定转速为5转/min测试时间为5 min按照分 组将大鼠放在滚筒中倾斜60。每次可测试3只大 鼠每只测试3次记录大鼠掉落平台时间长测试 时间为 5 min

2.5统计学方法所有计量资料均用均数±标准 X± s)表示Barnes记忆持续时间、大鼠进入隐藏 区的次数、进入的潜伏期以及滚筒掉落时间等参数 的比较采用单因素方差分析。统计结果,均由SPSS for windows 19.0自动运算完成P<0.01为有显著统 计学意义P<0.05为有统计学意义P>0.05为无统 计学意义。

3结果

3.1神经行为功能评分假手术组、电针对照组未 见神经行为功能缺损症状,电针后神经行为功能评 分较模型组降低,其中电针24 h降低无统计学意义 CP=0.23)电针7 d和14 d降低均有显著统计学意 义P7d = 0.002d < 0.001)说明电针可改善缺血性 脑卒中大鼠的神经行为功能评分。见表1。

表1各组大鼠神经行为功能评分比较(X±sn=10,分)

分组

24 h

7 d

14 d

模型组

2.97±0.41

2.82±0.34

2.78±0.31

假手术组

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00±0.00

电针对照组

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00±0.00

电针组

2.78±0.28

2.38±0.41**

1.73±0.43**

注:与模型组比较,**P<0.01

3.2进入隐藏区的潜伏期分析结果假手术组、电

针对照组大鼠进入隐藏区的潜伏期均较短,两者比 较差异无统计学意义CP24 h = 0.94、7 d = 0.90、PM d = 0.90),说明电针刺激对大鼠进入隐藏区的潜伏期无 直接影响。电针后大鼠进入隐藏区的潜伏期较模型组 缩短,其中电针24 h缩短有统计学意义CP24h<0.05)电针7d14d缩短有显著统计学意义P7〆 0.001,PMd<0.001),说明电针可改善缺血性脑卒中大 鼠进入隐藏区的潜伏期。见表2。

表2各组大鼠进入隐藏区的潜伏期比较(x±sn=10,分) 分组 24 h 7 d 14 d

238.57±2.74

3.27±0.97

3.19±1.33

233.10±4.11*

注:与模型组比较*P<0.05;与模型组比较**P<0.01

 

3.3 Barnes记忆持续时间假手术组、电针对照组 大鼠Barnes记忆持续时间差异无统计学意义CPz4h = 0.89、P7d = 0.74、PMd = 0.86),说明电针刺激对大鼠 Barnes记忆持续时间无直接影响;电针后Barnes记 忆持续时间较模型组延长,电针24 h、7 d和14 d延 长均有显著统计学意义(P4 h < 0.001P/ d < 0.001d <0.001),说明电针可改善缺血性脑卒中大鼠的空间 记忆能力。见表3。

3各组大鼠Barnes记忆持续时间比较(x眘10, s)

分组

24 h

7 ds

14 d

模型组

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00?.00

假手术组

14.79±2.75

16.35±3.01

18.66±3.77

电针对照组

14.92±3.23

16.71±2.93

18.41?.66

电针组

0.00±0.00

7.13±2.42**

12.61±3.93**

注:与模型组比较,**P<0.01

3.4滚筒掉落时间分析结果假手术组、电针对照

组大鼠滚筒掉落时间差异无统计学意义CP24h = 0.41、 P7d = 0.68、PMd = 0.74),说明电针刺激对大鼠滚筒掉 落时间无直接影响;电针后滚筒掉落时间较模型组延 长,其中电针24 h延长无统计学意义P = 0.53),电 针7 d和14 d延长均有显著统计学意义P/d< 0.001, PMd<0.00)说明电针可延长大鼠从滚筒上掉落的 时间。见表4。

4各组大鼠滚筒掉落时间比较(x眘,n=10 , s)

分组 24 h 7 d 14 d

模型组 38.78?1.16 55.60?3.59 79.25?4.10

假手术组 289.16?.17 289.49?.69 290.87?.72

电针对照组 284.77?3.78 286.0?2.89 289.17?0.32

电针组 42.13?1.27 109.54?1.99** 178.93?1.68**

注:与模型组比较**P<0.01 4讨论

缺血性脑血管病ICVD)属于中医学“中风”范 畴,其病机多是阴阳失调,血气运行受阻,血瘀滞络, 蒙蔽清窍而成[10]。针刺治疗,包括头皮针、电针等因具 有经济、简便、疗效确切等特点而广泛用于脑血管病 的治疗[11]

采用石学敏院士“醒脑开窍”针刺法来刺激该实 验大鼠,此法中的水沟、百会穴有醒脑、开窍、定志的 功效。大鼠水沟穴的定位取唇裂鼻尖下1 mm正中 处,直或向上刺1 mm;百会为“诸阳之会”,取顶骨正 中,向前、后斜刺2 mm[6]关于电针水沟穴治疗脑血 管病的机制研究颇多,李莎莎等[12]发现电针刺激水沟 穴可能通过调控微小RNA-126及其靶基因、促进脑 血管新生,从而提高反应神经功能损伤程度的 Berderson评分,促进大鼠脑缺血后的神经功能恢复。 Wang[13]研究发现电针水沟穴通过大电导Ca2+-K+通道(BKCa通道)的过度激活和表达可能是脑 缺血/再灌注损伤后神经元延迟死亡,从而改善缺血 再灌注大鼠神经功能。该实验选用水沟穴既有“醒脑 开窍”作用,又有现代机制方面研究的支撑。该实验发 现通过“醒脑开窍”刺法,可改善缺血性卒中大鼠的神 经功能评分,与李莎莎、Wang等的研究结果类似。

认知和记忆功能的研究属于神经心理学研究范 畴,神经心理学是当今“脑科学时代”的一门新兴学 科,它把脑当作心理活动物质载体从而研究脑与行为 的关系[1]。临床检测记忆或认知功能有韦氏记忆量 表MMSE简易智能精神状态量表以及MoCA量表 [14],研究[15-16]发现电针刺激可改善脑卒中后患者的 记忆和认知功能。然而,对于动物实验的研究,相关量 表完成困难,1976年Barnes发明了 Barnes迷宫,主 要用于测量动物的空间记忆功能,这与Morris水迷 宫相比对动物的刺激更少[17]。近年,随着信号通路的 不断被挖掘,研究动物认知和记忆功能则多基于认知 和记忆相关传导通路[18]、机制方面,Huang[19]发现电 针百会、神庭穴可下调大脑中动脉闭塞-再灌注大鼠 的促炎因子白细胞介素-1P表达水平,抑制星形胶质 细胞和小胶质细胞/巨噬细胞P2嘌呤受体介导的神 经炎性损伤Lin[20]通过电针百会、神庭穴可抑制脑 缺血再灌注大鼠模型的基质金属蛋白酶-2和基质金 属蛋白酶-9的表达,减轻脑超微结构损伤,从而提高 其记忆能力。Yu[21侧从另一角度研究记忆能力,发 现电针百会、大椎穴可提高事件相关电位P300,改善 脑梗死大鼠学习记忆能力。诱发电位中的事件相关电 位主要反映认知过程中大脑电生理的变化,其中 P300电位应用广泛。该实验通过观察大鼠Barnes 记忆持续时间、滚筒掉落时间等指标发现电针可改善 脑梗死模型大鼠的记忆功能。

该实验研究结果提示,Barnes迷宫实验表明电 针对照组、假手术组大鼠进入隐藏区的潜伏期缩 短、记忆持续时间延长优于电针组,电针组优于模 型组;滚筒掉落时间测试也表明电针对照组、假手 术组掉落时间延长优于电针组,电针组优于模型 组,反应“醒脑开窍”针刺法能使大脑中动脉闭塞模 型大鼠记忆

及运动能力改善,且在一定范围内,随 着电针时间的延长,记忆及运动功能改善越明显。 Barnes记忆分析系统及滚筒掉落时间可客观地反映 大鼠记忆及运动功能的变化。

虽然大鼠行为学研究的指标不能完全等同于人 类,但由于伦理学的限制,先在动物模型上做实验是 研究的必要途径。周鹏[22]等发现电针治疗脑缺血再灌 注损伤是通过多途径,作用于多靶点来实现的。该实 验目前仅观察了神经功能评分、Barnes记忆持续时 间、滚筒掉落时间等指标,记忆相关信号通路的各个 靶点,甚至大鼠事件相关电位P300等的是笔者下一 步研究的方向。

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