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1. 1 实验动物
SPF 级健康成年Sprague Dawley ( SD) 雄性大鼠82 只,鼠龄8 周,体质量180 ~ 200 g,购自北京维通利华实验动物中心,实验动物许可证号: SCXK( 京) 2016- 0011。正常饮食,实验环境清洁,温度25 ℃,昼夜交替12 h,饲养1 周以适应环境,每笼2 ~ 3 只。本实验通过首都医科大学动物伦理委员会批准( 伦理批号: AEEI-2018-017) 。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
1. 2 主要药品及试剂
微量给药套管购自瑞沃德公司; 微量进样针购自上海高鸽公司; Scopolamine hydrobromide 购自英国Tocris 公司( 批号: 114-49-8) ; Methoctramine hydrate ( 批号: 104807-46-7) 和Muscimol hydrobromide( 批号: 18174 - 72 - 6) 购自美国Sigma 公司。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
1. 3 主要仪器
东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点强迫游泳有机玻璃缸( 水深37 cm,桶高50 cm,直径30 cm) 购自武汉普百康科技发展有限公司。大鼠强迫游泳分析软件EthoVisionXT10 购自荷兰Noduls公司。旷场实验分析系统( 100 cm × 100 cm × 40 cm,底部为黑色,四周壁为黑色,无盖不透明塑料方箱) 购自上海欣软信息科技有限公司。
1. 4 实验方法
1. 4. 1 动物分组及处理
1) 通过强迫游泳实验明确东莨菪碱的抗抑郁样作用: 将14 只正常SD 大鼠采用数字表法随机分为东莨菪碱组和对照组,每组7 只,分别腹腔注射25 μg /kg 东莨菪碱或等体积0. 9% ( 质量分数) 氯化钠注射液,24 h 后通过旷场实验和强迫游泳实验评价东莨菪碱对大鼠抑郁样行为的影响。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
2) 利用γ-氨基丁酸-A ( γ-aminobutyric acid-A,GABA-A) 受体激动剂蝇蕈醇( Muscimol) 沉默内侧前额叶皮质( medial prefrontal cortex,mPFC) 神经元以明确东莨菪碱发挥抗抑郁效应的脑区: 将14 只正常SD大鼠采用数字表法随机分为Muscimol + 东莨菪碱组和东莨菪碱组,每组7 只,在腹腔注射25 μg /kg 东莨菪碱前1 h 分别向大鼠mPFC 立体定位注射Muscimol1. 25 μg 或等体积0. 9% ( 质量分数) 氯化钠注射液,24 h 后进行强迫游泳实验观察东莨菪碱的行为学效应是否被阻断。
3) 通过M2受体选择性拮抗剂MCT 侧脑室注射以明确M2受体是东莨菪碱抗抑郁的作用靶点: 将大鼠分为对照组和MCT 组,分3 批次分别向大鼠侧脑室注射0. 5 μg / 2 μL( 对照组和MCT 组各9 只) 、1 μg /2 μL( 对照组7 只,MCT 组10 只) 和2 μg /2 μLMCT( 对照组9 只,MCT 组10 只) ,对照组均给予2 μL0. 9%( 质量分数) 氯化钠注射液。24 h 后利用旷场实验和强迫游泳实验评价大鼠行为学变化。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
1. 4. 2 手术和给药
动物称体质量后,用1% ( 质量分数) 比妥溶液0. 5 mL /100 g腹腔注射麻醉。根据大脑立体定位图谱将套管埋置于双侧mPFC( 前囟前2. 8 mm,旁开3. 1 mm,深度3. 8mm,倾斜30°角) 或者侧脑室( 前囟后0. 9mm,旁开1. 5 mm,深度3. 5 mm) 。大鼠术后休息1 周后,通过微量给药系统经套管向双侧mPFC 注射Muscimol 或等体积0. 9% ( 质量分数) 氯化钠注射液,向双侧侧脑室注射不同剂量MCT 或2 μL 0. 9%( 质量分数) 氯化钠注射液,给药速度均为0. 2 μL /min,给药后留针5 min。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
1. 4. 3 旷场实验
用来评定大鼠自发性活动能力。提前将大鼠搬入测试室,使大鼠适应环境至少1 h。将大鼠放入旷场设备中心后,开始记录5 min 内大鼠在旷场内总路程,每次实验结束用稀释的乙醇*清洁旷场。测试过程采用SuperMaze视频记录分析软件( 上海欣软信息科技有限公司)记录并分析。东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点
1. 4. 4 强迫游泳实验
用来评价大鼠的绝望行为,是评价大鼠抑郁样行为的重要指标。于正式实验前24 h 将测试大鼠放入25 ℃水中,室温25 ℃,大鼠悬浮四肢不能触及桶底,15 min 后将大鼠取出、擦干后放回笼中; 次日在同样的条件下进行强迫游泳5 min,记录5 min 内大鼠静止不动时间( 大鼠仅有头部露出水面,身体飘浮在水中,四肢可有微动但不挣扎) ,测试过程采用摄影机记录。
2 讨论
近年来,东莨菪碱的快速抗抑郁治效果已被多项临床研究证实,东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为和旷场实验的影响及其作用靶点作用机制至今仍不清楚。作为M 受体的非选择性拮抗剂,东莨菪碱与M1 ~ M5 5 种M受体亚型均可结合,如能找到介导东莨菪碱抗抑郁作用的具体靶点,将对于研发快速起效抗抑郁药具有重要意义。
SuperFst强迫游泳实验分析软件